免疫荧光标记样品

用于流式细胞 仪检测的常用荧光素有FITC、TRITC、Cy3、Cy5，PE和PI，在以上各种荧光染料中，PE荧光最强，适用于弱表达抗原；FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广。

1．直接免疫荧光标记法

取一定量的细胞悬液（浓度约1×106 个/ml），直接加入荧光素标记抗体进行免疫反应（如做双重标记或多重标记染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入）。4℃孵育15～30分钟后，用1/15mol/LPBS（pH 7.2～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直接荧光抗体标记试剂成本较高。但减少了间接标记法中较强的非特异荧光干扰，因此更适用于临床标本的检测。

2．间接免疫荧光标记法

取一定量的细胞悬液（浓度约5×106 个/ml），加入特异性第一抗体，4℃孵育15～30分钟，待反应完全后用磷酸缓冲液洗去未结合抗体，吸尽残留液体，再加入荧光标记第二抗体，4~C孵育30分钟，生成抗原―抗体―抗抗体复合物，洗涤后即可上机检测。

注意：在整个荧光标记过程中均需参考免疫荧光细胞化学间接法染色程序，尤其是加入一抗前需使用正常非免疫血清封闭，以减少非特异性反应。如果对于未经固定的细胞需使用0.3%TritonX-100为细胞膜打孔，以保证抗体能够进入细胞内。

此法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研样品检测。但是，由于非特异性荧光背景较强，

影响实验结果，在样品制备时应加人阴性或阳性对照。另外，由于间接法步骤较多，尤其是经过多次洗涤，均可使细胞数量骤减，因此，在加入第一抗体前细胞悬液的细胞浓度约5×106个/ml，上机检测前不少于1×106 个/ml即可，此法不适用测定细胞数较少的样品。

3．荧光标记中的注意事项

① 为减少非特异性干扰，荧光标记物用前应用0．22um滤膜过滤或高速离心5分钟，以除去颗粒或沉渣。

② 细胞样品的制备、染色及保存均应该尽量保持新鲜，防止分解代谢引起的表面抗原消失及细胞死亡，可以通过加入营养培养基或低浓度血清以及4~0或冰浴中操作来解决。

③ 细胞稀少或低比例细胞亚群分析时，为保证准确，应排除死细胞。

④ 荧光标记抗体浓度应该合适，如果浓度过高，会使非特异性结合增加。在使用一抗之前，将样品与过量的牛血清白蛋白(BSA)或来源于同一种属的正常血清一起孵育，以阻断一抗和细胞表面或胞内结构非特异性作用。

在使用一抗之后，将样品、与二抗相同种属的5%～10%正常血清和二抗一起孵育，以减少二抗与一抗、细胞表面或胞内结构之间的非特异相互作用。如果使用含有与一抗或二抗种属相同的血清液体稀释抗体，便可以省略此步骤。