原理
一、不同来源样品的处理
1 . 培养细胞
（1）培养细胞用 0.25% 的胰酶消化。
（2）PBS 或生理盐水洗涤细胞 2 次，再用 PBS 或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为 60%-70% ，快速混匀，并用封口膜封口，置 4℃ 下可保存 15 天左右。
2. 新鲜标本
（1）将标本切成 1-2 mm3 的小块。
（2）PBS 或生理盐水清洗后去除上清，加入 0.2％ 胶原酶（或0.15％ 胰蛋白酶）37℃ 消化 10-30 min（根据实验及不同组织确定），并不断振动。
（3）300 目尼龙筛过滤，除去组织团块，PBS 洗涤 2 次，300g 离心 5 min，获得已消化的细胞。
3. 石蜡包埋标本
（1）标本在切片机上切取 3-5 片 50 μm 厚的组织片。
（2）将切片彻底脱蜡，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸馏水水化。
（3）0.5％ 胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃ 消化 30 min，每隔 10 min 振动 1 次。
（4）300 目尼龙筛过滤，获得的细胞悬液 PBS 洗涤 2 次，300xg 离心 5 min。
注意：脱蜡一定要完全（若加入 100％ 乙醇无絮状物飘起即可）；切片厚薄适宜，太薄碎片多，影响 FCM 分析结果，太厚易造成脱蜡不净；注意掌握消化时间，避免已释放的细胞被消化。
二、制备
1. 取 1×106 个细胞 /100 μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应 30 min。
2. 用 PBS 洗涤细胞 2 次，离心沉淀弃掉上清液（离心转数一般为 800-1000 rpm，5 min）。
3. 用 100 μl PBS 重悬细胞，再加入 FITC 或 PE 标记荧光二抗（用量均按说明书要求加入）混匀，室温下反应 30 min。
4. 用 PBS 再洗涤细胞 2 次，加入 500 μl PBS 重悬成单细胞悬液，上机检测。
材料与仪器
实验样品；
抗体、PBS 溶液；
移液器、移液吸头、离心机；
步骤
一、不同来源样品的处理
1 . 培养细胞
（1）培养细胞用 0.25% 的胰酶消化。
（2）PBS 或生理盐水洗涤细胞 2 次，再用 PBS 或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为 60%-70% ，快速混匀，并用封口膜封口，置 4℃ 下可保存 15 天左右。
2. 新鲜标本
（1）将标本切成 1-2 mm3 的小块。
（2）PBS 或生理盐水清洗后去除上清，加入 0.2％ 胶原酶（或0.15％ 胰蛋白酶）37℃ 消化 10-30 min（根据实验及不同组织确定），并不断振动。
（3）300 目尼龙筛过滤，除去组织团块，PBS 洗涤 2 次，300g 离心 5 min，获得已消化的细胞。
3. 石蜡包埋标本
（1）标本在切片机上切取 3-5 片 50 μm 厚的组织片。
（2）将切片彻底脱蜡，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸馏水水化。
（3）0.5％ 胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃ 消化 30 min，每隔 10 min 振动 1 次。
（4）300 目尼龙筛过滤，获得的细胞悬液 PBS 洗涤 2 次，300xg 离心 5 min。
注意：脱蜡一定要完全（若加入 100％ 乙醇无絮状物飘起即可）；切片厚薄适宜，太薄碎片多，影响 FCM 分析结果，太厚易造成脱蜡不净；注意掌握消化时间，避免已释放的细胞被消化。
二、制备
1. 取 1×106 个细胞 /100 μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应 30 min。
2. 用 PBS 洗涤细胞 2 次，离心沉淀弃掉上清液（离心转数一般为 800-1000 rpm，5 min）。
3. 用 100 μl PBS 重悬细胞，再加入 FITC 或 PE 标记荧光二抗（用量均按说明书要求加入）混匀，室温下反应 30 min。
4. 用 PBS 再洗涤细胞 2 次，加入 500 μl PBS 重悬成单细胞悬液，上机检测。
注意事项
1. 以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。
2. 制备好的样品，若不能及时上机检测，用 1%-4% 的多聚甲醛固定，4℃ 下可保存 5 天。
常见问题
此法由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。此外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
来源：丁香实验
