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流式细胞术的样品制备

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19362

(一)不同来源样品的处理

1. 培养细胞

(1)培养细胞用0.25%的胰酶消化。

(2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次,再用PBS或生理盐水悬浮细胞,加入预冷的无水乙醇,终浓度为60%~70% ,快速混匀,并用封口膜封口,置4℃下可保存15天左右。

2. 新鲜标本

(1)将标本切成1~2mm3的小块。

(2)PBS或生理盐水清洗后去除上清,加入0.2%胶原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10~30min(根据实验及不同组织确定),并不断振动。

(3)300目尼龙筛过滤,除去组织团块,PBS洗涤2次,300g离心5min,获得已消化的细胞。

3. 石蜡包埋标本

(1)标本在切片机上切取3~5片50μm厚的组织片。

(2)将切片彻底脱蜡,梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸馏水水化。

(3)0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30min,每隔10min振动1次。

(4)300目尼龙筛过滤,获得的细胞悬液PBS洗涤2次,300g离心5min。

注意:脱蜡一定要完全(若加入100%乙醇无絮状物飘起即可);切片厚薄适宜,太薄碎片多,影响FCM分析结果,太厚易造成脱蜡不净;注意掌握消化时间,避免已释放的细胞被消化。

(二)直接免疫荧光标记的样品制备

用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色,然后用流式细胞仪检测,阳性者即表示有相应抗原存在。实验步骤如下:

1. 每份取100μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。

2. 一份加入相应量的FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗,另一份加入荧光标记的无关单抗,作为同型对照样品。

3. 室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行),一般在室温下反应15~30min即可。

4. 加入500μl PBS重悬成单细胞悬液即可上机检测。

(三)间接免疫荧光标记的样品制备

1. 取1×106个细胞/100μl,先加入一抗混匀,置室温下避光反应30min。

2. 用PBS洗涤细胞2次,离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800~1000rpm,5min)。

3.用100μl PBS重悬细胞,再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀,室温下反应30min。

4. 用PBS再洗涤细胞2次,加入500μl PBS重悬成单细胞悬液,上机检测。

注意:以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间,一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明,应先进行预实验,掌握好剂量与最佳反应时间后,再进行流式样品的制备。制备好的样品,若不能及时上机检测,用1%~4%的多聚甲醛固定,4℃下可保存5天。

(四)DNA荧光染色的样品制备

DNA是细胞内含量比较恒定的参量,随着细胞增殖周期的各时相而发生变化。荧光染料(如PI)可选择性地定量嵌入核酸(DNA/RNA)的双螺旋碱基之间,与细胞特异性结合,DNA含量与荧光染料的结合量成正比,因此通过测定荧光强度可获知细胞的增殖情况。

1. 将固定过的细胞离心(500~1000rpm,5min)弃上清液,再用PBS洗涤2次。

2. 用PBS调整细胞浓度,每份为1×106个细胞/100μl。

3. 加入1000μl DNA 荧光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色试剂盒),室温下避光染色15 min。

4. 上流式细胞仪检测。

以上样品的制备可分析细胞周期各时相的百分比,同时可粗略观察有无凋亡细胞现象,如果用对照液(鸡红细胞)作参照标准,可进行细胞DNA倍体分析,通过DNA指数(DNA index,DI)衡量DNA的相对含量,DI可用下式计算:

DI=样品G0/G1期的均值/正常二倍体细胞G0/G1期均值

(五)细胞凋亡检测样品的制备

根据实验方案诱导细胞凋亡,制备单细胞悬液,使用 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒,通过Annexin V抗体与磷脂丝氨酸(PS)的特异性结合来检测细胞凋亡的情况。

1. 将10×的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1×,冰育。

2. 悬浮细胞在低温环境中,用PBS洗涤细胞2次(800~1000rpm离心,5min)。

3. 弃上清,加入490μl预冷的结合缓冲液重悬细胞(细胞浓度为105~106/ml)。

4. 加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI于细胞悬浮液中,轻轻混匀。

5. 将试管置于冰上,避光孵育10分钟。

6. 上FCM检测。

(六)微量全血法免疫荧光标记的样品制备

目前制备全血细胞样品的方法很多,且很成熟,常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,然后进行特异性荧光染色,其染色方法与前面介绍的方法相同。下面主要介绍与流式细胞仪配套的Q-PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法。

1. 微量全血直接荧光染色法

(1)取肝素或EDTA抗凝全血(100μl/份),置12×75mm专用塑料试管中。

(2)每份加入20μl特异性荧光单抗,另一份加入荧光标记的无关单抗作同型对照,室温下避光染色15min。

(3)置 Q-PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞,静置5min。

(4)上流式细胞仪检测。

2. 微量全血间接荧光染色法

(1)取肝素或EDTA抗凝全血(100μl/份),置12×75mm专用塑料试管中。

(2)加入50μl特异的单克隆抗体(一抗),室温下孵育30min。

(3)置Q-PREP仪上溶解红细胞,稳定和固定白细胞。

(4)离心(800~1000rpm,5min)弃上清液,用PBS洗涤细胞2次。

(5)加入50μl荧光(FITC或PE)标记的第二抗体,室温下避光染色30min。

(6)上流式细胞仪检测。

3. 注意事项

(1)新鲜全血一般室温下放置8小时以内可以使用,时间过长会使活性降低,影响测定结果。

(2)抗凝血应保证无血块凝集。

(3)全血加入试管中时,应尽量避免加到试管壁上,如沾到了管壁上必须用用棉签擦净,否则会影响细胞二维点图的细胞群的分离效果。

(七)样品制备应注意的问题和影响因素

1. 样品制备应注意的问题

(1)单细胞悬液的制备是流式细胞术分析的关键。如遇有细胞团块应先用300~500目的细胞筛网过滤后,再上机检测。

(2)标本采集后要及时固定或深低温保存,手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时,要避免出血与坏死组织。

(3)免疫荧光标本应注意死细胞和碎片的去除,要求每份样品中杂质、碎片、团块重叠细胞应<2%,尤其是稀少细胞或细胞亚群的测定时,否则这些细胞的非特异性荧光增加,会干扰免疫荧光测定。

(4)细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度,一般每份样品要求的细胞数为5×105/ml~1×106/ml,对肿瘤细胞DNA异倍体的样品分析,至少应有20%的肿瘤细胞存在(占主峰1/5以上的异倍体才可确认为异倍体峰)。

(5)石蜡包埋组织单细胞制备时要注意:选取含待测细胞丰富的区域;石蜡组织片的厚度要适宜,最好为40~50μm;彻底脱蜡,以免残留的石蜡影响酶的消化活性;充分水化,使组织还原到与新鲜组织相似的状态。

2. 影响样品制备的因素

(1)温度对荧光强度的影响:一般认为,温度升高时荧光减弱,所以在荧光测量时要保持染色后的样品在适当低温环境下进行,并尽可能减少样品的光照射时间。有条件时,应使样品观察室做到恒温装备,使温度对荧光染色的影响减少到最小,会得到更好的荧光定量测定的结果。

(2)pH值对荧光强度的影响:每一种荧光染料分子发光的最高量子产额,都有自己最适合的pH值,以保持荧光燃料分子与溶剂间的电离平衡,如果pH值发生改变,可能造成荧光光谱的改变,如FITC在酸性溶剂中呈蓝色荧光,为阳离子发光;在碱性溶剂中呈黄绿色荧光,为阴离子发光

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