流式细胞术的样品制备

（一）不同来源样品的处理

1． 培养细胞

（1）培养细胞用0.25%的胰酶消化。

（2）PBS或生理盐水洗涤细胞2次，再用PBS或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为60%～70% ，快速混匀，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。

2． 新鲜标本

（1）将标本切成1～2mm3的小块。

（2）PBS或生理盐水清洗后去除上清，加入0.2％胶原酶（或0.15％胰蛋白酶）37℃消化10～30min（根据实验及不同组织确定），并不断振动。

（3）300目尼龙筛过滤，除去组织团块，PBS洗涤2次，300g离心5min，获得已消化的细胞。

3． 石蜡包埋标本

（1）标本在切片机上切取3～5片50μm厚的组织片。

（2）将切片彻底脱蜡，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸馏水水化。

（3）0.5％胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃消化30min，每隔10min振动1次。

（4）300目尼龙筛过滤，获得的细胞悬液PBS洗涤2次，300g离心5min。

注意：脱蜡一定要完全（若加入100％乙醇无絮状物飘起即可）；切片厚薄适宜，太薄碎片多，影响FCM分析结果，太厚易造成脱蜡不净；注意掌握消化时间，避免已释放的细胞被消化。

（二）直接免疫荧光标记的样品制备

用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。实验步骤如下：

1． 每份取100μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。

2． 一份加入相应量的FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为同型对照样品。

3． 室温下避光反应一定时间（时间长短根据试剂说明书要求进行），一般在室温下反应15～30min即可。

4． 加入500μl PBS重悬成单细胞悬液即可上机检测。

（三）间接免疫荧光标记的样品制备

1． 取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30min。

2． 用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液（离心转数一般为800～1000rpm，5min）。

3．用100μl PBS重悬细胞，再加入FITC或PE标记荧光二抗（用量均按说明书要求加入）混匀，室温下反应30min。

4． 用PBS再洗涤细胞2次，加入500μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。

注意：以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。制备好的样品，若不能及时上机检测，用1%～4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。

（四）DNA荧光染色的样品制备

DNA是细胞内含量比较恒定的参量，随着细胞增殖周期的各时相而发生变化。荧光染料（如PI）可选择性地定量嵌入核酸（DNA/RNA）的双螺旋碱基之间，与细胞特异性结合，DNA含量与荧光染料的结合量成正比，因此通过测定荧光强度可获知细胞的增殖情况。

1． 将固定过的细胞离心（500～1000rpm，5min）弃上清液，再用PBS洗涤2次。

2． 用PBS调整细胞浓度，每份为1×106个细胞/100μl。

3． 加入1000μl DNA 荧光染料（通常用Coulter公司提供的DNA染色试剂盒），室温下避光染色15 min。

4． 上流式细胞仪检测。

以上样品的制备可分析细胞周期各时相的百分比，同时可粗略观察有无凋亡细胞现象，如果用对照液（鸡红细胞）作参照标准，可进行细胞DNA倍体分析，通过DNA指数（DNA index，DI）衡量DNA的相对含量，DI可用下式计算：

DI＝样品G0/G1期的均值／正常二倍体细胞G0/G1期均值

（五）细胞凋亡检测样品的制备

根据实验方案诱导细胞凋亡，制备单细胞悬液，使用 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒，通过Annexin V抗体与磷脂丝氨酸（PS）的特异性结合来检测细胞凋亡的情况。

1． 将10×的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1×，冰育。

2． 悬浮细胞在低温环境中，用PBS洗涤细胞2次（800～1000rpm离心，5min）。

3． 弃上清，加入490μl预冷的结合缓冲液重悬细胞（细胞浓度为105～106／ml）。

4． 加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI于细胞悬浮液中，轻轻混匀。

5． 将试管置于冰上，避光孵育10分钟。

6． 上FCM检测。

（六）微量全血法免疫荧光标记的样品制备

目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。下面主要介绍与流式细胞仪配套的Q-PREP（免疫学样品处理器）进行快速制备微量全血样品的方法。

1． 微量全血直接荧光染色法

（1）取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm专用塑料试管中。

（2）每份加入20μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作同型对照，室温下避光染色15min。

（3）置 Q-PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5min。

（4）上流式细胞仪检测。

2． 微量全血间接荧光染色法

（1）取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm专用塑料试管中。

（2）加入50μl特异的单克隆抗体（一抗），室温下孵育30min。

（3）置Q-PREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞。

（4）离心（800～1000rpm，5min）弃上清液，用PBS洗涤细胞2次。

（5）加入50μl荧光（FITC或PE）标记的第二抗体，室温下避光染色30min。

（6）上流式细胞仪检测。

3． 注意事项

（1）新鲜全血一般室温下放置8小时以内可以使用，时间过长会使活性降低，影响测定结果。

（2）抗凝血应保证无血块凝集。

（3）全血加入试管中时，应尽量避免加到试管壁上，如沾到了管壁上必须用用棉签擦净，否则会影响细胞二维点图的细胞群的分离效果。

（七）样品制备应注意的问题和影响因素

1． 样品制备应注意的问题

（1）单细胞悬液的制备是流式细胞术分析的关键。如遇有细胞团块应先用300～500目的细胞筛网过滤后，再上机检测。

（2）标本采集后要及时固定或深低温保存，手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血与坏死组织。

（3）免疫荧光标本应注意死细胞和碎片的去除，要求每份样品中杂质、碎片、团块重叠细胞应<2％，尤其是稀少细胞或细胞亚群的测定时，否则这些细胞的非特异性荧光增加，会干扰免疫荧光测定。

（4）细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，一般每份样品要求的细胞数为5×105／ml～1×106／ml，对肿瘤细胞DNA异倍体的样品分析，至少应有20%的肿瘤细胞存在（占主峰1/5以上的异倍体才可确认为异倍体峰）。

（5）石蜡包埋组织单细胞制备时要注意：选取含待测细胞丰富的区域；石蜡组织片的厚度要适宜，最好为40～50μm；彻底脱蜡，以免残留的石蜡影响酶的消化活性；充分水化，使组织还原到与新鲜组织相似的状态。

2． 影响样品制备的因素

（1）温度对荧光强度的影响：一般认为，温度升高时荧光减弱，所以在荧光测量时要保持染色后的样品在适当低温环境下进行，并尽可能减少样品的光照射时间。有条件时，应使样品观察室做到恒温装备，使温度对荧光染色的影响减少到最小，会得到更好的荧光定量测定的结果。

（2）pH值对荧光强度的影响：每一种荧光染料分子发光的最高量子产额，都有自己最适合的pH值，以保持荧光燃料分子与溶剂间的电离平衡，如果pH值发生改变，可能造成荧光光谱的改变，如FITC在酸性溶剂中呈蓝色荧光，为阳离子发光；在碱性溶剂中呈黄绿色荧光，为阴离子发光