样品制备

电镜酶细胞化学反应分两步：

①细胞内酶在一定条件下与底物进行初级酶反应（形成初级产物）；

②应用捕捉剂与初级产物反应形成电子致密物质。

电镜酶细胞化学捕捉方法很多，最常用于水解酶类的为金属盐沉淀法和应用于氧化还原酶类的为嗜锇物质形成法。金属盐沉淀法原理是酶反应初级产物与重金属结合形成不溶解的电子致密物，常用铅、铈等。嗜锇物质形成法原理是氧化酶类和二氨基联苯胺（DAB）反应形成嗜锇中间产物，然后与锇形成高电子密度的锇黑沉淀。

1. 取材组织取材 10 mm × 5 mm × 5 mm 左右大小，固定后用振荡切片机切成 40～100 μm 厚片，也可用剃须刀片手工切厚片。取白细胞和骨髄时采用细胞分离液分离外周血。取培养细胞时用橡皮刮。游离细胞经离心（800 r/min）5 min，凝块后用剃须刀片切成厚片，漂洗备用。

2. 固定固定方式与免疫电镜基本相同，分为血管灌注固定（10～15 min）、浸泡固定（15～30 min）、微波辐射固定（5～10 s），并控制温度。

3. 置换缓冲液将组织厚片换入配制孵育液用的缓冲液中，换液 3 次，每次间隔 5～10 min。

4. 孵育把组织厚片放在新鲜配制的孵育液中，在振动式恒温水浴箱中孵育。孵育温度和时间可根据不同酶和组织通过实验确定。

5. 漂洗厚片先用配制孵育液的缓冲液漂洗，一般换 3 次，每次间隔 5 min，然后用 0.1mol/L 二甲胂酸钠缓冲液漂洗 3 次。

6. 后固定用二甲胂酸钠配制的 1％ 四氧化锇固定 1～2 h。

7. 包埋按超薄切片技术中的常规方法进行梯度脱水及树脂浸透、包埋。

8. 超薄切片与染色常规超薄切片，铀、铅染色。

9. 对照实验电镜细胞化学反应的对照实验同样也是必不可少的，主要有以下几种方法：

9.1 去除孵育液中的底物；

9.2 孵育液中加特异性抑制剂；

9.3 高温使酶失活，一般 60℃1 h 以上可以灭活酶的活性。