电镜与样品制备技术

电镜样品取材方法
1　动物及人体组织的取材
动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1㎜宽，2～3㎜长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成１㎜3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（0～4℃）。
2　体外培养细胞的取材
生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置3～5min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将含有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2000转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。
3 植物组织的取材
植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。

电镜样品取材的基本要求
⑴　快　取材的动作要迅速，最好在材料离体后１min内就进入固定液；解剖器械要锋利，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。
⑵　准　取材要准确。①　器官要准确　②　部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。
⑶　冷　取材过程应尽量在低温下进行（0～4℃），以降低酶的活性，减少细胞内结构的损失。
⑷　小　所取材料体积要小，一般不超过1㎜3。因为固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。　

电镜制样中常用固定剂的配制方法
⑴　缓冲液的配制
Ａ、磷酸缓冲液（0.2M）的配制方法如下：
甲液：Na2HPO4.12H2O 　　71.64g
　　　加蒸馏水溶解成 　1000ml
乙液：NaH2PO4.2H2O 　　31.21g
　　　加蒸馏水溶解成 　1000ml
按下表混合甲、乙两液即得所需PH的磷酸缓冲液
表1：0.2M的磷酸缓冲液的配制（50ml）
　PH 　　　6.4 　6.6 6.8 7.0 　7.2 7.4
甲液（ml） 13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5
乙液（ml） 36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5
磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定液，并适于作灌注固定。本缓冲液的缺点是固定时容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存。
B、 二甲胂酸盐缓冲液（0.2M）
甲液：二甲胂酸钠 4.28g
加蒸馏水至 100ml
乙液：0.2N盐酸
按表2混合甲、乙两液后，将总体积稀释成200ml即可获得不同PH的缓冲液
表2：二甲胂酸钠缓冲液的配制
　　PH 　6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4
甲液（ml） 50 50 50 50 50 50
乙液（ml） 18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7
本缓冲液比较稳定，不易生长细菌，可长期保存，与低浓度的钙质（1-3mM）不发生沉淀反应。缺点是胂有毒性、有臭味，配制时应在通风橱中进行。

 

⑵ 常用固定液的配制
A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为25%的水溶液）
表3：0.1M磷酸缓冲戊二醛的配制
戊二醛最终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0
0.2M磷酸缓冲液（ml） 50 50 50 50 50 50 50
25%戊二醛水溶液（ml） 4 6 8 10 12 16 20
双蒸水加至（ml） 100 100 100 100 100 100 100
B、0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液
表4：0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液的配制
戊二醛最终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0.2M二甲胂酸钠缓冲液（ml） 50 50 50 50 50
25%戊二醛水溶液（ml）　　　4 6 8 10 12
双蒸水加至（ml） 　　　100 100 100 100 100
C、多聚甲醛-戊二醛固定液
取2克多聚甲醛粉末溶于25毫升蒸馏水，65℃下不断搅拌，加1-3滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加5毫升5%戊二醛，加二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液（0.2M，pH7.2-7.6）使总体积到50毫升，并加25毫克无水氯化钙。混合液的pH为7.2。本液对微管有良好的保存作用。

透射电镜的成像原理　　　
目前，主流的透射电镜镜筒是电子枪室和由6～8级成像透镜以及观察室等组成。阴极灯丝在灯丝加热电流作用下发射电子束，该电子束在阳极加速高压的加速下向下高速运动，经过第一聚光镜和第二聚光镜的会聚作用使电子束聚焦在样品上，透过样品的电子束再经过物镜、第一中间镜、第二中间镜和投影镜四级放大后在荧光屏上成像。电镜总的放大倍数是这四级放大透镜各级放大倍数的乘机，因此透射电镜有着更高的放大范围（200×～1000000×）。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

透射电镜的一般操作流程
接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空，当镜筒真空达到一定要求时，再由扩散泵抽镜筒的高真空，当高真空能达到加高压的要求时，面板上高真空指示灯点亮，表明此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值，稍等一会待高压稳定后，再增加灯丝电流，使荧光屏中心产生一个明亮的光斑，随后依次接通各级透镜的工作电流，调整电镜的工作状态，调整好后再加入样品进行观察，并对感兴趣的部位拍照记录。电镜使用完毕，应依次关闭高压、灯丝加热电流、关闭各级透镜工作电流以及取出样品。待冷却水再工作10～15min后，关闭电镜和冷却水。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

电镜在 生物 医学领域中的应用
17世纪光学显微镜的发明，促进了细胞学的发展，20世纪电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥妙。在20世纪60年代以来，电镜广泛应用于工农业生产、材料学、考古学、 生物 学、组织学、病毒学、病理学和分子生物学等众多研究领域中。但电镜技术从应用的广度、研究的深度等方面看，没有哪一个领域可与生物医学相媲美。
1 在细胞学方面：由于超薄切片技术的出现和发展，人类利用电镜对细胞进行了更深入的研究，观察到了过去无法看清楚的细胞超微结构。例如，用电镜观察到了生物膜的三层结构以及细胞内的各种细胞器的形态学结构等。
2 电镜在发现和识别病毒方面起到了重要作用：许多病毒，尤其是肿瘤病毒就是用电镜发现的。电镜也为病毒的分类提供了最直观的依据，例如去年肆虐全球的SARS病毒就是首先在电镜下观察到并确认是病毒而不是支原体的。
3 在临床病理诊断方面：生物体发生疾病都会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过对病变区细胞的电镜观察就可以为疾病诊断提供有力依据。例如目前电镜在肾活检、肿瘤诊治中发挥了重要作用。
4 电镜技术与生命科学中新兴起的技术相结合，促进了新技术的应用。例如电镜技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况等。　

 

透射电镜在生物医学研究中的主要技术
1 常规超薄切片技术
一般的透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须切成厚度为50~70nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。在透射电镜的生物医学样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。利用透射电镜观察超薄切片，可以了解细胞的精细结构。　
2 负染色技术
负染色技术也叫阴性反差染色，它是由Hall等首先采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简单易行和快速方便等优点。因此在生物学研究中广泛应用。这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特征。尤其是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的相互作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。
3 金属投影与复型技术
金属投影技术是利用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams首先用这种技术用于增加电镜图象的反差。该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。复型技术主要用于样品表面结构的研究。某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。通过对该复型样品的观察，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特征。
4 冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术
冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，而且还揭示了某些前所未见的新结构，尤其是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。
5 电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。其中最主要的是蛋白质（尤其是酶的细胞内定位），其次是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。该技术有利的促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。
6 免疫电镜技术
免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后利用电镜在超微结构水平上鉴定抗原-抗体的结合反应。在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。
7 电镜放射自显影技术
电镜放射自显影技术是一种利用放射性 同位素 作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，而且还用于显示抗原-抗体的结合， 激素 或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。因此这是一种非常有用的现代生物学技术。