电镜组织化学技术样品制备

良好的样品制备是电镜酶细胞化学技术成功的关键。酶电镜组织化学 样品制备要求既要保存酶的活性，同时又要保存细胞的超微结构。并能防止酶反应产物扩散。每种酶对固定液的要求和显示方法虽不尽相同。但电镜酶组织化学的基本程序相似，下面简要介绍其基本要求：

1．取材 组织标本的取材是样品制备的第一步，非常重要。所以，取材前应做好计划和充分准备。原则上。目标要明确，操作要迅速。临床标本取材时还应注意：

①活检钳的刀口必须锋利。以免挤压组织：

②取材部位必须是主要病变区；

③手术标本除病变部位外，还应分别取病灶与正常组织交界区和远距病灶区的正常组织作对照。

2．固定 常用的固定剂为2%～4%多聚甲醛和0.5%～2%戊二醛。以0.1mol/LPB或二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)配制，固定时间为30―60分钟(4℃)。注意：固定液的浓度越高，时间越长，越易引起酶失活；对于不同组织和酶，最好通过预实验选择合适的固定液浓度和固定时间。

3．漂洗 用与配制固定液相同的缓冲液充分漂洗组织，4℃，1～2小时为宜。

4．切片 组织标本经含蔗糖的缓冲液浸洗3小时以上，用振动切片机或冰冻切片机将组织切成30―50gm厚片，有利于孵育液从切片两面充分渗透入组织中，与细胞内的酶反应。

5．预孵育 切片经充分漂洗后用不含底物的孵育液预孵10分钟。

6．孵育 将切片移至含适当底物和捕捉剂的液体孵育，使其发生特异的细胞化学反应。孵育的温度和时间通常以35℃、30～60分钟为宜，温度不宜超过37℃，温度过高或孵育时间过长，容易导致反应产物的弥散。

注意：为得到较理想的实验结果．最好通过预实验确定孵育温度和时间；应根据实验需要于用前新鲜配制相应的孵育液；所用试剂纯度要高，器皿须清洁；孵育液中底物和捕捉剂的浓度、pH值和缓冲液的缓冲能力等必须配合适当。

另外，配制孵育液应按配方顺次加入各种试剂，应一种试剂溶解后再加入另一种试剂，最终配制的孵育液应清澈透明，必要时，可过滤除去沉淀后应用。

7．后处理 一般用冷缓冲液漂洗切片终止孵育，继之用2.5%戊二醛进一步固定，并根据需要可用1%OsO4，进行适当的后固定(4℃,30～60分钟)。注意：OsO4 固定后，酶反应产物易溶于水，故OsO4：固定时间以不超过60分钟为宜。

8．脱水、包埋、超薄切片制作、电子染色以及观察 按第一节常规电镜方法进行。但是脱水时间可缩短1/2左右。注意：初次实验最好不对超薄切片进行电子染色而直接进行电镜观察。以了解组织细胞超微结构的保存和反应产物的分布情况，确认电子染色是否影响酶细胞化学反应产物的电镜观察。

9．对照实验 为确保实验结果的可信性，任何实验 方法均需必要的对照实验，酶组织细胞化学技术尤其如此。鉴定酶细胞化学反应特异性的方法较多。主要包括在孵育液中不加底物，或加入酶的特异性抑制剂，或采用热变性及消化等方法使酶失活，对照实验应不存在酶反应的沉淀产物。