电镜原位杂交技术实验

一、超薄冰冻切片的组织固定

1.用干净的玻璃器皿或者一次性器皿配制固定剂

2.用新鲜配制的固定剂

3.2%~4% 的多聚甲醛和0.2% 戊二醛固定组织。戊二醛对于确保良好的超微结构是必要的。然而由于固定剂的交联特性，更高浓度（>0.5%) 则严重阻碍探针的穿透。因此，对于要用于研究的毎个样本，必须在超微结构保持和探针穿透性之间找到平衡点。

二、固定和样本制备

小块组织采用浸泡固定。对于大的组织，如大鼠的脑，建议用灌注固定法。

1.过浸泡固定小块组织，4℃ 过夜。

2.Imol/L 磷酸盐缓冲液洗涤组织 2 次，每次 10 min。

3.用含有 0.15% 甘氨酸的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液洗涤 2 次，每次 10 min。用含 2.3mol/L 的蔗糖 PBS 液浸泡组织至少 4 h，在浸泡时持续滚动小管子。

三、标本制备

在切片前将组织块固定在标本支持物上；我们一般用铜钉固定。

1.用砂纸将钉子表面打粗糙。

2.洗涤钉子以去除小的金属碎片。

3.用 70% 乙醇洗涤钉子并用吸水纸干燥。

4.从蔗糖溶液中取出组织并用解剖显微镜将组织定位于钉子上。. 用吸水纸吸去过多蔗糖。

5.用干净的镊子把带样本的钉子放入液氮。

6.在液氮中储存样本直至使用

四、切片

1.把组织样本从液氮罐转移至超薄切片机时，应确保没有融化。

2.超薄冰冻切片的理想温度为 100~120℃。

3.用干刀完成切片。

4.常做一个厚切片（500nm) 用来定位组织以及检查固定效果。这种厚切片能用 1% 甲苯胺蓝溶液染色。

5.细修剪标本边缘能改善超薄切片质量。可用剃须刀片或者玻璃刀完成。

6.对于薄切片（40~80nm)，建议使用金刚石刀。

7.用接种环把切片从刀片上分离下来。这种接种环是一个 I5 cm 的塑料把手接了一个小金属套圈（直径 2 mm)，金属套圈充满 2.3md/L 蔗糖或是蔗糖/甲基纤维素混合液。

8.用接种环收集切片后，让它们短暂解冻，并立即转移到筛网上。

9.用蔗糖/甲基纤维素混合液收集切片有两个优点，一是形态结构保持得更好更完整，二是筛网在冰箱中至少能储存 3 个月。

10.用透明塑料包被或碳包被的镍网；铜网在处理过程中会氧化，形成肮脏的沉淀，从而干扰电镜成像。

五、电镜原位杂交步骤

将筛网（切片面朝下）放到含有 2% 明胶溶液的带盖培养皿上，在电热板上 (37℃) 放置 5 min，然后在 37℃ 孵箱内放置 20 min。

以下步骤都在小滴液体中完成。将小滴试剂（探针和抗体溶液用 5~10ul, 洗涤用 100ul) 点在封口膜蜡上，把筛网切片面朝下放在小滴上。

该方法选用了蛋白 A-金交联物。因为蛋白 A 与兔 IgG 的亲和力高，而与羊 IgG 的亲和力低，抗地高辛抗体多为山羊抗体，所以采用兔抗山羊二抗作信号放大的中介。

1.于 0.15% 甘氨酸的 PBS 温育 2 次，每次 5 min。

2.用 2XSSC 温育 2 次，每次 5 min。

3.在无探针的杂交缓冲液中预杂交 20 min。

4.加 O.Ig 探针液到 10ul 杂交混合液。

5.杂交筛网放入一个密闭容器中，同时放入湿滤纸以防杂交缓冲液蒸发，于 50C 置 3 h。

6.用 2XSSC 温育 Imin。

7.用 50% 甲酰胺和 2XSSC 混合液洗涤 2 次，每次 5 min。

8.在密闭和湿化的容器中，于 50°C 用 50% 甲酰胺/2XSSC 混合液严格洗涤 3 次, 每次 20 min。

9.用 2XSSC 洗涤 2 次，每次 5 min。

10.用含 I%BSA 的 PBS 洗涤 3 次，每次 5 min。

11.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 lOmin。

12.在山羊抗地高辛抗体（1:100 稀释于含 1% 鱼明胶的 PBS) 中室温下温育 Ih 或者 4C 过夜。

13.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 5 min。

14.用含有 1%BSA 的 PBS 洗涤 3 次，每次 10 min。

15.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 5 min。

16.在兔抗羊抗体（1:100 稀释于含 1% 鱼明胶的 PBS) 中温育 30 min。

17.用含有 1% 鱼明胶的 PBS 洗涤 5 min。

18.用含有 1%BSA 的 PBS 洗涤 3 次，每次 10 min。

19.在蛋白 A-胶体金交联物（稀释于 1%BSA 的 PBS，稀释比例依据使用说明）中温育 20 min。

20.PBS 洗涤 3 次，每次 15 min。

21.在含 1% 戊二醛的 PBS 中固定 10 min。

22.PBS 洗涤 5 min。

23.蒸馏水洗涤 5 次，每次 Imin。

24.在 2% 乙酸双氧铀液中温育 5 min。

25.用乙酸双氧铀/甲基纤维素洗涤 2 次，每次 Is。

26.将切片包埋于乙酸双氧铀/甲基纤维素中，置冰上 10 min。

27.用接种环从甲基纤维素液体小滴上移去筛网。

28.用滤纸去除过多的甲基纤维素，将筛网留在接种环上并让它风干 30 min。

29.转移筛网到筛网盒中

六、免疫细胞化学

电镜原位杂交（EM-ISH) 与免疫细胞化学组合十分方便，在上述第 22 步后，接用以下方法：

1.用含有 0.15% 甘氨酸的 PBS 洗涤 3 次，每次小于 10 min。

2.用含 1% 鱼明胶和 I%BSA 的 PBS 洗涤 5 min。

3.与抗体（兔抗，稀释于 1% 鱼明胶和 1%BSA 的 PBS) 温育 45 min。

4.用含 I%BSA 的 PBS 洗涤 5 次，每次 Imin。

5.与蛋白 A-胶体金交联物（稀释于 1%BSA 的 PBS) 温育 20 min，可采用不同大小的金比较 ISH 信号的显示。

6.下接电镜原位杂交方法的第 20 步。

七、结果

以往的研究已经显示，在软体动物椎实螺，能合成卵生激素（ELH) 的神经元的轴突内含有大量编码 ELH 的 mRNAVanMinnen1994)。我们用 EM-ISH 研究这些编码神经肽的 mRNA 的超微结构定位。首先，我们研究了 ELH 转录物在合成 ELH 神经元胞体内的定位。正如所料，发现它们主要与粗面内质网膜相关（图 3-2A)。其他细胞器中（如线粒体、高尔基体、分泌囊泡）则没有显示 ELH 转录物的存在，这一点可以从图 3-4 中观察到，上述细胞器并未出现 ISH 信号（小金颗粒）和 ELH 免疫反应性物质（大金颗粒）的共定位。然后，我们研究了 ELH 转录物在神经元轴突内的精确定位，发现它们主要位于轴浆中（图 3-3), 在含有 ELH 的核致密囊泡中则没有其转录物的存在，这一点与以前的报道相符（Dirks1996)。

在实验中，我们主要观察了编码 ELHmRNA 的超微结构定位，同时也发现山羊抗地高辛抗血清能与含有 ELH 的核致密囊泡交叉反应。为了避免这一问题，我们使用了鼠抗地高辛单克隆抗体（步骤 12), 然后在第 16 步用兔抗鼠抗体来替代原来使用的兔抗羊抗体。以上数据进一步说明做 ISH 时设立正确对照实验的必要性。