待检测样品制备
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生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，必须将样品进行生物处理。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度，但这一过程操作起来却有一定的难度。比如在一个癌细胞中有成千上万个正常基因的干扰，杂合癌基因的检测和对它的高效、特异地扩增就不是一件容易的事。因为在一般溶液中PCR扩增时，靶片段太少且不易被凝胶分离，故存在其它不同的DNA片段与其竞争引物的情况。美国Mosaic Technology公司发展了一种固相PCR系统。此系统包含两套引物，每套都可以从靶基因两头延伸。当引物和DNA样品及PCR试剂相混时，如果样品包含靶序列，DNA就从引物两头开始合成，并在引物之间形成双链DNA环或"桥"。由于上述反应在固相中产生，因而避免了引物竞争现象，并可减少残留物污染和重复引发。
根据样品来源、基因含量、检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。
样品制备的常用试剂：对于检测表达的芯片，样品制备通常涉及（m）RNA的纯化，cDNA的合成，体外转录或者PCR，标记等步骤。而对于SNP或者突变检测，则往往涉及Genomic DNA纯化和PCR、标记等步骤。
1. RNA纯化：
从样品中分离纯化高质量的RNA是非常重要的第一步。由于RNA样品中的DNA碎片会影响后继的PCR反应，所以要彻底除去样品中的DNA。通常用mRNA纯化的方法可以除去DNA片断，或者用RNase-Free的DNase处理RNA样品。在这里我们介绍一些常用的RNA纯化试剂盒，特别是由Affymetrix公司推荐的QIAGEN RNA纯化系列。
一旦生物样品被收集分离，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等实验来说，采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的，往往需要将液氮或者干冰带到采样现场，采样后立即抽提RNA或者运回实验室保存。对于实验者来说非常不方便。
著名的QIAGEN公司最近新推出一种RNA抽提试剂：RNeasy Protect Kit，提供一整套RNA保护和分离试剂，从样品的制备到RNA的抽提，只需一个试剂盒即可解决所有问题。保证样品的表达信息不受破坏，确保得到可信的基因表达分析结果。
试剂盒里提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNA保护剂可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。保存在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天，或者在18-25度保存7天，2-8度稳定4周，或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样，运输和保存样品提供了极大的方便，特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞，但必须说明的是它不适用于全血或体液中RNA的保存。
RNAlater的用法非常简单，只要在采样后立即将样品完全浸入适量（10ul/1mg组织）的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索，组织样品的大小以不超过0.5公分厚为宜，对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官则可以整个取出浸入溶液中，较大的则应切开为厚度小于0.5公分的小块，以确保RNAlater 能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液，避免组织块挤在一起，同时建议将溶液加满容器以避免在运输过程中组织块露出液面。注意本试剂只适用于新鲜样品，对于冷藏和包埋的样品直接抽提RNA即可。另外对于RNA已经降解的样品，RNAlater只能保护剩下的样品RNA，不能修复已破坏的RNA。
保存后的样品可以直接用于RNA或者mRNA的抽提。RNAlater不会影响组织块的结构，可以在室温下切出适量的组织块用于称量和抽提RNA，剩下的部分可用于继续保存样品。-20度冻存的样品可以取出在室温下进行称量等操作而无需干冰。在-20度冻存的样品反复冻融20次RNA依然保持完好无损。RNAlater处理的样品比新鲜组织稍微硬一点，但不会影响匀浆过程。取出适量的样品即可开始加RLT缓冲液进行匀浆化。
和传统的RNeasy Kit一样，RNeasy Protect Kits采用QIAGEN著名的硅胶膜纯化柱技术，迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，只要洗脱即可得到纯的RNA。通常情况下RNeasy的纯化技术足以除去绝大部分的DNA，而无需额外进行DNaes处理，但是对于一些对痕量DNA非常敏感的实验，用RNase-Free DNase Set（QIAGEN cat.no. 79254）可以直接在纯化柱上消化DNA残留，在随后的洗涤步骤中除去DNase，最后洗脱得到不含DNA的纯RNA。
试剂盒具有以下优点：
·迅速稳定并保护RNA，确保基因完整、基因表达信息可靠。
·由于RNA Stabilization试剂，您可以放心地在室温下操作，方便、安全--无须液氮和干冰。
·确保RNA不受降解--即使多次冻溶也不受影响。
·简单、快速和可靠RNA分离--使用于所有下游分析的即用型RNA。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
74124 RNeasy Protect Mini Kit(50) 3181.00
75152 RNeasy Protect Midi Kit(10) 1313.00
75182 RNeasy Protect Maxi Kit(12) 4140.00
76104 RNAlater RNA Stabilizationeagent 682.00
_QIAGEN_RNeasy_Total_RNA纯化系列（Affymetrix推荐！）
采用QIAGEN著名的硅胶膜纯化柱技术，迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，只要20分钟（Mini Kit）到1小时（Maxi Kit）即可直接从样品中提取高质量的Total RNA。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
74104 RNeasy Mini Kit (50)
75142 RNeasy Midi Kit (10~undefined
75162 RNeasy Maxi Kit (12~undefined
74903 RNeasy Plant Mini Kit (20)
Direct系列产品无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，不到30分钟可直接从样品中纯化出高质量的mRNA，可用于各种常规应用以及芯片分析，显微注射，建库，消减杂交，SAGE技术等要求很高的的实验。回收率高达90%以上。以下是部分产品信息。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
72012 Oligotex Direct mRNA Micro Kit
72022 Oligotex Direct mRNA Mini Kit
72041 Oligotex Direct mRNA Midi/Maxi Kit
70022 Oligotex mRNA Mini Kit
70042 Oligotex mRNA Midi Kit
_QIAamp_RNA_Blood_Mini_Kit~K~Hp~M~2~1~Kp~M专为从新鲜全血中快速提取高质量的RNA而设计，专利设计的QIAshredder和QIAamp离心纯化柱让你彻底摆脱酚氯仿抽提和离心沉淀的苦恼，简便快速地纯化出适用于各种用途的优质RNA。 QIAamp Viral RNA Mini Kit则适用于从各种无细胞的体液、血清、尿液、CSF中分离RNA，回收率高达90%以上。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
52304 QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)
52904 QIAamp Viral RNA Mini Kit (50)
2. Genomic DNA的分离纯化：
对于Genotyping、SNP分析和Genomic Chip来说，要检测基因组或者染色体上的突变就需要制备样品的基因组DNA而非RNA以进行检测。在这里简单介绍几个常用的试剂盒。
QIAGEN公司专利的样品纯化技术方便快速从多种临床样品中纯化高质量的Genomic DNA，无需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。根据不同的样品来源可以选择特定的试剂盒。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
51104 QIAamp DNA Blood Mini Kit(50)
51183 QIAamp DNA Blood Midi Kit(20)
51192 QIAamp DNA Blood Maxi Kit(10)
51304 QIAamp DNA Mini Kit(50)
51504 QIAamp DNA Stool Mini Kit(50)
DNeasy System 是QIAGEN公司为除临床样本以外的其他样本，如动物组织、血液、酵母、细菌、植物等快速制备基因组DNA而设计的，采用硅胶膜技术，无需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。单个离心柱或96孔纯化板满足不同的需求。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
69504 DNeasy Tissue Kit(50)
69103 DNeasy Plant Mini Kit(20)
69104 DNeasy Plant Mini Kit(50)
68161 DNeasy Plant Maxi Kit(6)
3. 探针的制备和标记：
对于表达芯片分析，常用的有以下几种方法制备和标记探针：将纯化的样品RNA通过特定的引物逆转录合成单链cDNA探针，在合成的过程中掺入标记物；或者先将待测样品的RNA转录合成cDNA，再进一步通过加入标记物进行体外转录合成cRNA单链探针，又或者将合成的cDNA加标记物和特殊引物进行PCR扩增，制备成标记的双链探针。而对于SNP芯片和突变检测，则需要将纯化的基因组DNA用特定的引物扩增并进行标记。由于不同的DNA Array供应商对于标记有不同的要求，我们在下面分别介绍。
1）Affymetrix的表达芯片：
要求制备样品的cRNA探针。为保证制备出足够的cRNA用于杂交和每一步的样品分析，Affymetrix公司推荐用1μg以上的mRNA（最少0.2μg以上）或者5μg以上的总RNA开始合成cDNA。以HPLC纯的T7-(dT)24 Primer(推荐选用GENSET公司的产品，要求是HPLC纯的，PAGE胶纯化的引物在这里不适用)作为逆转录引物合成cDNA。由于引物中带有T7序列，因此合成的cDNA的3'端也带有T7序列。选用Affymetrix公司提供的Enzo BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit(Cat.No.900182,10次标记)，通过试剂盒提供的生物素标记的核糖核酸和T7 RNA聚合酶，以体外转录（IVT）的方式扩增并标记cRNA探针。试剂盒提供体外转录和标记的所有试剂，可以作10个反应。标记好的探针经过随机片断化（fragmentation，试剂自行配制）后得到大小约为35-200个碱基大小的RNA片断即可和芯片进行杂交。
2）Affymetrix公司的Genotyping（如人类SNP图谱分析芯片）和健康研究芯片：
这一类芯片用于检测样品基因组的变异，因而只需纯化基因组DNA，并用配套的Primer进行PCR扩增。HuSNP的配套试剂盒里还提供标记好的引物。而对应2种健康研究芯片，Affymetrix公司则提供Enzo BioArray Terminal Labeling Kit进行末端荧光标记。
3） Clontech公司的Atlas Pure Total RNA Labeling System：
这是一个从Total RNA中制备同位素标记的cDNA探针的试剂盒。利用生物素偶联的Oligo（dT）和磁珠偶联的Streptavidin将mRNA吸附到磁珠上，加入MacroArray（包括尼龙膜基质和塑料基质）提供的基因特异引物混合物（CDS Primer）、同位素标记物和逆转录酶，直接在磁珠上合成同位素标记的cDNA探针，最后从磁珠上洗脱标记好的探针，纯化后即可用于杂交。这个标记试剂盒可以从少至10μg的total RNA中制备适用于Clontech公司各种尼龙膜基质和塑料基质MacroArray的高质量cDNA探针。由于将mRNA纯化和cDNA探针合成、标记合为一体，方便用户的同时还可节约成本。这个系统不适用于玻片芯片的探针标记。
4） Clontech公司的SpotLight Chemiluminescent System
这种专为Clontech公司各种尼龙膜基质的Macroarray设计的化学发光试剂盒助你彻底从同位素中解放出来，让你轻松快速、高灵敏度地进行各种尼龙膜基质的杂交印迹和MacroArray的非放射性检测。两种标记试剂盒（Atlas SpotLight Labeling Kit和SpotLight Random Primer Labeling Kit）适应不同的研究需要，配合通用的杂交检测试剂盒（SpotLight Chemiluminescent Hybridization & Detection Kit），即可组合出完整的非放射性检测分析系统。不过这个系统不适用于玻片基质的芯片的探针标记。
由于Atlas系列的DNA微阵列膜上每个点的核酸量有限，所以对标记探针的灵敏度要求非常高，一般情况下同位素是首选。如今Atlas SpotLight标记试剂盒特别提供逆转录所需的试剂，可以将2μg以上的mRNA或者50μg以上的RNA样品制备成生物素标记的单链cDNA探针，由于没有竞争性抑制，单链探针的灵敏度要大大高于双链探针。另外生物素标记的探针比32P标记的探针要稳定，可以在半年内多次重复使用。
对于Southern、Northern和多组织Northern预制杂交膜（MTN）、多组织表达矩阵（MTE）等以尼龙膜为基质的杂交、印迹反应，可以选用SpotLight随机引物标记试剂盒进行标记，和同位素标记一样简单，但却更加安全、容易处理，而且生物素标记的探针稳定时间更长。
配套通用的杂交检测试剂盒里提供特殊配方的SpotHyb杂交液，能有效降低背景，减少非特异杂交，提高灵敏度。HRP偶联的Streptavidin能高效专一地结合生物素标的探针。采用了加强型的化学发光试剂，信号强且发光信号可以持续6小时之久，通常压片5-10分钟，一旦结果不理想，允许反复压片。相比同位素需要压片过夜，SpotLight让你当天就得到实验结果，可谓安全、方便、快速多了；而相比常规化学显色法，SpotlLight化学发光法的灵敏度要高的多，信号更清晰、干净，而且不会出现一旦显色过度就不可逆转的毛病。
5) Clontech Atlas Glass Fluorescent Labeling Kit
这是一个间接荧光探针标记试剂盒，标记好的荧光探针适用于各种玻片基质的DNA芯片。在试剂盒提供的dNTP Mix中以氨基化的dUTP（Aminoallyl-dUTP）代替普通的dUTP（这种修饰不影响合成效率），加入2μg以上的样品mRNA或者20μg以上的total RNA，以及基因特异性引物（一般由芯片试剂盒提供）和逆转录酶，合成氨基修饰的cDNA。这时只要加入N-羟琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide）活化的荧光染料（自备）进行偶联反应，荧光染料的活化基团就会和cDNA中的修饰dUTP上的氨基偶联，从而生成荧光标记的cDNA探针。荧光染料可以是Cy3、Cy5、FITC、fluorescein、Texas red、rhodamine、bodipy或者Alexa dye，而且各种荧光染料的标记效率相当。值得一提的是这种间接荧光标记比直接标记法的效率更高，在双色荧光标记时，可以避免直标法因为Cy5标记效率低而导致Cy3、Cy5两种颜色信号强度不同的现象。试剂盒提供除荧光染料外的全部试剂，足够作10次标记。
6）Vysis公司的Microarray Nick Translation Kit
是配合Vysis公司的Genomic Microarray--AmpliOnc I Microarray的荧光标记试剂盒，采用缺口平移的方法将荧光标记的dUTP掺入纯化的样品基因组DNA中作为探针，和AmpliOnc I Microarray进行杂交。
4．用于多次反复杂交的可洗脱探针制备技术：
Ambion公司的Strip-EZ RT Kit是专门为尼龙膜基质的Macroarray，以及各种预制杂交膜而设计的cDNA探针合成标记试剂盒。我们在前面介绍过尼龙膜基质或者塑料基质的Macroarray的优点之一是在杂交检测后可以将膜上结合的探针洗脱，因而膜可以重复使用多次，能够一定程度的降低每一次的使用成本。常规的膜再生方法需将膜放在SDS溶液中煮沸一定时间，因而会对膜和膜上的信号造成损耗，通常重复使用3次后已经得不到清晰的信号。
Strip-EZ RT试剂盒的工作原理是在逆转录酶合成cDNA探针的同时掺入经修饰过的脱氧核苷酸（专利技术，这种修饰不会影响探针的杂交特性）和标记核苷酸，合成的探针与膜经过杂交、检测后将膜浸入Probe Degradation Buffer中5分钟，修饰过的脱氧核苷酸降解，探针即被降解寡核苷酸碎片，再将膜浸入再生Buffer中68℃下温和地洗脱降解的寡核苷酸碎片，膜即可再生。Strip-EZ RT Kit制备的cDNA探针可以在非常温和的条件下（试剂由试剂盒提供）洗脱原有的杂交信号，减轻对膜的伤害，延长膜的使用寿命，降低膜的使用成本。数据表明经过9-15次反复洗脱后的膜依然能得到清晰的杂交信号(见图，左边为STRIP-EZ标记探针，右边为普通探针，膜经过1，3，5，10，15轮反复杂交-洗脱-再杂交后检测信号）这个试剂盒可用于同位素标记和非放射性标记，需要0.5-1μg以上的mRNA或者10μg以上的total RNA作为起始材料，不过厂家推荐尽可能的使用纯化的mRNA，因为使用total RNA会导致较高的非特异背景，影响检测。
Ambion公司针对不同厂家的Macroarray还推出了优化条件的专用试剂盒Array-Advantage AA Kit （Cat.No. 1857，for Clontech's Atlas Nylon Array)， Array-Advantage GF Kit (Cat.No. 1855, for Research Genetics' GeneFilters Array， Array-Advantage UA Kit （Cat.No.1853, for Ambion's ULTRArray)。除了Strip-EZ RT所需试剂外，这种试剂盒里还提供探针纯化柱（30），可以除去探针中多余的标记物和杂质，同时还提供适用于尼龙膜的快速杂交液（500ml）、20xSSC（1L）、10%SDS（1L）等试剂和需要用到的指管。对于需要RNA探针或者DNA探针的用户，Strip EZ还有RNA、DNA和PCR三种不同的试剂盒可供选择。
以上各种方法都要求较大量的起始材料（通常要1μg以上的mRNA），对于那些数量很少的样品该怎么办呢？对于细胞数量不少于1000或者质量不少于100μg的样品，可以选用Clontech公司的SMART PCR cDNA Synthesis Kit（K1052—1）结合Atlas SMART Probe Amplification Kit。SMART技术是利用逆转录酶在逆转录反应过程中遇到mRNA5’端帽子结构时会自动加若干个dCTP的特性，在反应体系中加入末端带若干个G的SMART Oligonucleotide与之形成匹配，使逆转录酶以SMART引物为模板继续延伸合成的cDNA，从而使合成的cDNA5’端带上SMART引物的对应序列，就可以直接用PCR进行扩增。因此只要少至50ng的total RNA就可以通过扩增得到足够的材料来合成探针。扩增后的cDNA加入基因特异性引物（如果没有，可以用随机引物，但会导致背景升高和灵敏度降低）、Klenow酶、SMART Blocking Solution和标记物合成cDNA探针。这个SMART Blocking Solution可以阻断前面的SMART引物，避免对后继的探针合成和杂交产生影响。SMART技术经过优化后可以保证扩增后的cDNA基本保持原始RNA样品的复杂度和相对丰度，因而合成的探针也保持同样的代表性。
对于更少的样品，比如用Laser Capture Nicrodissection激光显微俘获系统从组织切片上挑选的少量细胞或者手术切下的较小的组织块（例如活组织检查切片），则可以考虑以下方法：用带有T7序列的Oligo（dT）和特别灵敏的QIAGEN Sensiscript RT Kit（适用于特别少量的RNA样品，如单细胞RT-PCR）将样品RNA反转录为带T7序列的cDNA，再用Ambion公司的MEGAscript High Yield Transcription Kit进行体外转录，大量扩增mRNA后再用不同的方法制备探针。Ambion公司专利的大规模合成RNA技术可以在较短时间内合成大量RNA，其产量为常规方法的10—50倍，最长可以合成常达16kb的转录本，特别适合少量样品中低丰度的RNA扩增。另外也可以选择Ambion公司的Cell-to-cDNA试剂盒，则可以避免少量样品抽提RNA的麻烦，通过细胞裂解、RNAse失活和DNAse消化到cDNA合成，直接合成cDNA，然后再配合MEGAscript High Yield Transcription Kit扩增RNA，最后标记探针。
另外，由于标记后需要去除标记反应中的杂质和未掺入的标记物才能进行杂交，我们在这里另外介绍几个纯化探针的产品：
QIAGEN公司的QIAquick Nucleotide Removal Kit（Cat.No.28304, 50preps）独特的硅胶膜技术能够在5分钟内纯化10μg从17mer—40mer的单链DNA或者40bp—10kb的双链DNA，能去除99%以上的<10mer的寡核苷酸或者dNTP。特别适合去除同位素标记反应中的未掺入的标记物。Ambion公司的NucAway Spin Columns（Cat.No.10070，30preps）一步离心即可有效去除未掺入的标记物和盐，特别适合探针纯化，保证无RNase、DNase污染。
Clontech公司的CHROMA SPIN olumn（Affymetrix推荐！）是一类预装微型凝胶过滤柱，用时只要拆开两端密封，离心--上样--离心，即可有效去除样品中的小分子杂质，3种不同的缓冲液适合不同需要：TE Buffer适合常规的DNA纯化，STE（TE+0.1M NaCl）适合需要较高盐浓度以防止样品分子间的离子相互作用，而DEPC-H2O（+0.1M EDTA）适合RNA的纯化。每一种缓冲液均有6种不同的型号，根据凝胶孔径的不同，分离样品的范围可从15mer到Genomic DNA。
另外，有的研究人员习惯用酚氯仿抽提纯化核酸，除了对人体有害，酚氯仿抽提的另一个问题是：为避免将中间层的蛋白杂质或有机相连同上清一起吸出，往往需要弃去一部分上清不要，这种情况会造成相当一部分样品损失，特别是小体积的酚抽提。所以我们在这里介绍一个新产品，相信大家一定会喜欢：Eppendorf公司的Phase Lock Gel（Affymetrix推荐！）只要将酚氯仿和样品的混合物加入预装有Phase Lock Gel的管子里，离心，这种专利的化合物就会在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，你可以轻松的吸出全部水相样品，提高回收率而不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。对于大体积的样品抽提，还可以直接将全部水相倒出而有机相依然被牢牢“锁定”在管底不会流出。Phase Lock Gel不会影响常规的酶反应，你可以在装有Phase Lock Gel的管子里进行酶切，加热失活，再进行酚抽，离心后酚被锁在固相之下，再直接加入酚氯仿抽提，再离心，Phase Lock Gel会重新在新的水相和有机相之间形成固体，将全部有机溶液锁在固体层之下，相当方便。Phase Lock Gel分为PLG Heavy和PLG Light两种，前者适用于碱法提质粒、RNA抽提等杂质较多（粘稠）的情况（不适合纯酚抽提），后者适用于酶切反应、cDNA合成、标记反应和常规组织Genomic DNA纯化（Mouse tail除外），适用于纯酚、酚氯仿、氯仿抽提。
