FACS法检测样品mTNF
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FACS 法检测样品mTNF
【基本原理】
利用荧光标记的抗TNF McAb的免疫荧光技术和激光激活原理，通过FACS（荧光激活流式细胞分离术），即可对膜表面结合有TNF的单核/巨噬细胞进行定性或定量分析与分离。
【材料和试剂】
（1） 制备好的单核/巨噬细胞悬液
（2） 含2%人血清、0.1%叠氮钠的PBS及PBS
（3） FITC（异硫氰酶荧光素）标记的抗TNF McAb
（4） 兔抗TNF多克隆抗体
（5） FITC标记的羊抗兔IgG
（6） 圆底96孔细胞培养板，离心机，温浴箱，刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），CO2 培养箱，流式细胞液，细胞计数板
【操作步骤】
（1） 将单核/巨噬细胞加或不加激活剂，37℃，5%CO2 培养箱中培养一定时间；
（2） 将单核/巨噬细胞悬液以2000r/min离心10min， 弃上清；
（3） 用含2%人血清10.1%叠氦钠的PBS重新悬液细胞，1×106 ml；
（4） 将细胞悬液加入圆底96孔细胞培养板中，100μl/孔或者1×105 /孔；
（5） 再加入FITC标记的抗TNF McAb，置冰上20min；
（6） 用PBS洗板4次后，用流式细胞仪分析荧光阳性细胞（即mTNF阳性细胞）的百分率及平均荧光强度，并可进行分离。
【注意事项】
上述介绍的为直接法，要求具备FITC标记的抗TNF McAb，如无FITC标记的抗TNF McAb，则可采用间接法，操作步骤如下：
（1）～（4）步同上
（1） 加入1：500稀释度的兔抗TNF多克隆抗体，置冰上20min；
（2） 用PBS洗板1次，以去除未结合的抗体。
（3） 再加入1：500稀释度的FITC标记的羊抗兔IgG，置冰上20min；
（4） 用PBS洗板4次后，用流式细胞仪分析荧光阳性细胞（即mTNF阳性细胞）的百分率及平均荧光强度，并可进行分离。
