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FACS法检测样品mTNF

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FACS 法检测样品mTNF
 
【基本原理】
利用荧光标记的抗TNF McAb的免疫荧光技术和激光激活原理,通过FACS(荧光激活流式细胞分离术),即可对膜表面结合有TNF的单核/巨噬细胞进行定性或定量分析与分离。
【材料和试剂】
(1)         制备好的单核/巨噬细胞悬液
(2)         含2%人血清、0.1%叠氮钠的PBS及PBS
(3)         FITC(异硫氰酶荧光素)标记的抗TNF McAb
(4)         兔抗TNF多克隆抗体
(5)         FITC标记的羊抗兔IgG
(6)         圆底96孔细胞培养板,离心机,温浴箱,刻度吸管,毛细吸管,加样器(头),CO2 培养箱,流式细胞液,细胞计数板
【操作步骤】
(1)         将单核/巨噬细胞加或不加激活剂,37℃,5%CO2 培养箱中培养一定时间;
(2)         将单核/巨噬细胞悬液以2000r/min离心10min, 弃上清;
(3)         用含2%人血清10.1%叠氦钠的PBS重新悬液细胞,1×106 ml;
(4)         将细胞悬液加入圆底96孔细胞培养板中,100μl/孔或者1×105 /孔;
(5)         再加入FITC标记的抗TNF McAb,置冰上20min;
(6)         用PBS洗板4次后,用流式细胞仪分析荧光阳性细胞(即mTNF阳性细胞)的百分率及平均荧光强度,并可进行分离。
【注意事项】
    上述介绍的为直接法,要求具备FITC标记的抗TNF McAb,如无FITC标记的抗TNF McAb,则可采用间接法,操作步骤如下:
(1)~(4)步同上
(1)         加入1:500稀释度的兔抗TNF多克隆抗体,置冰上20min;
(2)         用PBS洗板1次,以去除未结合的抗体。
(3)         再加入1:500稀释度的FITC标记的羊抗兔IgG,置冰上20min;
(4)         用PBS洗板4次后,用流式细胞仪分析荧光阳性细胞(即mTNF阳性细胞)的百分率及平均荧光强度,并可进行分离。
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