溴化乙锭法

溴化乙锭（EB）是一种嵌入型染料，其上的一个菲啶环可插入到 DNA 或 RNA 链的堆积碱基之间。溴化乙锭的嵌入基团与碱基的接近使二者紧密结合。

DNA 吸收 254 nm 的紫外辐射并传递能量给 EB，而 EB 本身在 302 nm 和 366 nm 处有光吸收。吸收的能量在 590 nm 处释放，并表现为橙红色荧光。结合的EB的荧光产率远大于游离 EB 的荧光产率。

EB 结合量的多少与 DNA 的大小和构型有关，而荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。对于单一构型的同种 DNA 样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的 DNA 含量成正比。

标准 DNA 样品（已知浓度的线性化 DNA，以 TAE 稀释为梯度浓度的一系列标准样品）

质粒 DNA 的酶切样品（待测）

溴化乙锭 EB 5 μg/ml（用 PH 8.0的 TAE 稀释 10 mg/ml 母液制备而成）

紫外透射仪

1、在黑色塑料板上点两排溴化乙锭 2 μl 液滴，每排六点。

2、取标准样品 2 μl 与第一排溴化乙锭混匀，使各点的 DNA 浓度分别为 20、15、10、5、2、1（单位：ng/μl）。

3、取待测样品经过梯度稀释后，各加 2 μl 于第二排的溴化乙锭上混匀。

4、把以上塑料板放到紫外投射仪的样品台上，关好样品室门。以短波紫外光激发荧光，观察每一点的荧光强度或拍照。

5、比较上下两排的亮度，确定待测样品的浓度。

1、标准样品含单一种类的 DNA，且大小与待测样品相近。

2、待测样品和标准样品使用同样的体积。

3、EB 具有中度毒性、强致癌性，操作时切记戴手套，切勿沾染到衣物、皮肤、眼晴、口鼻等。

4、沾有 EB 的用具使用完毕统一集中于回收容器中，经净化处理后方可弃。

5、该方法只能估计样品 DNA 浓度，无法得到具体浓度，更推荐使用 Nanodrop 2000 测定 DNA 浓度。

1. 如何选择合适的标准样品大小？

答：通过预实验，选择大梯度标准样品估计待测样品大致大小，再缩小标准样品梯度进行正式实验。