流式细胞术检测样品推荐制备方法

A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：

(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。

(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。

(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。

(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法：

（1）收集2×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。

（2）用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；

（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。

（4）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。

（5）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。

（6）加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。

（7）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：

（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。

（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存 ，至少固定18小时。

（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。

（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。