原理
一、材料准备
1. 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备
（1）将 BALB/c 小鼠眼球放血处死，用 750 mL/L 乙醇消毒小鼠皮肤后。
（2）腹腔注射 5 mL RPMI 1640 基础培养基。
（3）轻揉小鼠腹部 5 min，从侧腹壁小心抽吸出液体，收集细胞到 15 mL 的离心管中，于 4℃ 以 1500 r/min，离心 5 min，弃上清，用 RPMI 1640 基础培养基重悬，并将细胞密度调整为 2×109 个细胞 /L，接种到 96/24 孔细胞培养板中，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养。
（4）3 h 后弃上层培养液，用冷的 RPMI 1640 基础培养基轻轻洗涤 2 次，去除未贴壁细胞即得已贴壁的巨噬细胞。
（1）将 BALB/c 小鼠眼球放血处死，用 750 mL/L 乙醇消毒小鼠皮肤后。
（2）腹腔注射 5 mL RPMI 1640 基础培养基。
（3）轻揉小鼠腹部 5 min，从侧腹壁小心抽吸出液体，收集细胞到 15 mL 的离心管中，于 4℃ 以 1500 r/min，离心 5 min，弃上清，用 RPMI 1640 基础培养基重悬，并将细胞密度调整为 2×109 个细胞 /L，接种到 96/24 孔细胞培养板中，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养。
（4）3 h 后弃上层培养液，用冷的 RPMI 1640 基础培养基轻轻洗涤 2 次，去除未贴壁细胞即得已贴壁的巨噬细胞。
二、实验步骤
1. 对照实验
（1）实验设置空白对照组（加 DMEM 完全培养液）、对照组（加巨噬细胞悬液）、Sal 80 μmol/L 组、Sal 160 μmol/L 组和 Sal 320 μmol/L 组，每组设 3 个复孔。
（2）将取密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种于 96 孔板中，每孔添加 190 μL 的 RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 的 Sal 工作液，使其终浓度分别为 80 μmol/L、160 μmol/L 及 320 μmol/L，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养 48 h。
（3）每孔加入20 μL （质量浓度为 5 mg/L）MTT，避光孵育 4 h 后，离心（1500 r/min，5 min）弃上清，每孔加 100 μL 二甲基亚砜（DMSO），于振荡器上避光振荡 10 min 以溶解孔底紫色结晶，在酶标仪于 490 nm 波长检测各孔吸光度值，并计算细胞的相对存活率。
（4）细胞相对存活率 = [（不同浓度的 Sal 组的 A 值 - 空白对照组的 A 值）/（对照组的 A 值-空白对照组的 A 值）] × 100%。
2. 采用 MTT 比色法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组和 Sal+LPS+IFN-γ 组，每组设 3 个复孔。
（2）将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 96 孔板中，每孔添加 190 μL 的 RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）培养 4 h。
（3）加入 LPS（终浓度为 10 mg/L）和 IFN-γ（终浓度为 80 μg/L），于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养 48 h。
（4）每孔加入 20 μL 的 MTT（终浓度为 5 mg/L），继续培养 4 h 后离心（1500 r/min，5 min）。
（5）弃上清，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪于波长 490 nm 检测 A 值，并计算 Sal 对巨噬细胞的增殖促进率。
（6）促进率 = [（Sal+LPS+IFN-γ 组的 A 值 - LPS+IFN-γ 组的 A 值）/ LPS+IFN-γ 组的 A 值] × 100%。
3. 采用 Sytox Green 染色法检测
（1）实验设对照组、CHX 和 Sal+CHX 组，每组设 3 个复孔。
（2）将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 96 孔板中，添加 190 μL RPMI 1640 基础培养基，将 10 μL 终浓度为160 μmol/L 的 Sal 工作液加入到贴壁的巨噬细胞中。
（3）培养 4 h 后，在 CHX 组加入终浓度为 0.5 μmol/L 的CHX，继续于 37℃、50 mL/L CO2 孵箱中培养 48 h。
（4）加入终浓度为 0.5 μmol/L 的 Sytox Green 对 96 孔板中的巨噬细胞室温下染色 15 min，用荧光酶标仪检测巨噬细胞 Sytox Green 染色的荧光强度。
4. 采用免疫荧光微球法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组、不同浓度的 Sal 组和Sal+LPS+IFN-γ 组，每组设 3 个复孔。
（2）将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 24 孔培养板中，每孔加 500 μL RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）。
（3）37℃、50 mL/L CO2 培养箱 4 h。
（4）加入终浓度为 10 mg/L 的 LPS 和终浓度为 80 μg/L 的IFN-γ，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中孵育 24 h，最后加入直径为 1 μm 的荧光微球（终浓度为 1×1010/L），继续培养 2 h。
（5）轻轻吸掉上清，用 PBS 轻轻洗涤清除未吞噬的微球，然后用胰酶将贴壁的腹腔巨噬细胞消下来。
（6）收集细胞，离心（1500 r/min，5 min），用 200 μL PBS重悬后立即用 FCM 进行检测。
5. 采用 H2DCFDA 染色法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组和 Sal+LPS+IFN-γ 组，每组设 3 个复孔。
（2）按照密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 96 孔培养板中，每孔加入 190 μL 的 RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）。
（3）37℃、50 mL/L CO2 培养箱 4 h。
（4）加入终浓度为 10 mg/L 的 LPS 和终浓度为 80 μg/L 的IFN-γ，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中孵育 24 h。
（5）弃上清，用终浓度为 5 μmol/L 的 H2DCFDA 染液，每孔加 100 μL 染液避光室温染色 30 min。
（6）用荧光酶标仪进行检测，其发射光波长为 485 nm，检测光波长为 520 nm。
6. 采用 Griess 试剂盒法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组和 Sal+LPS+IFN-γ 组，将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 24 孔培养板中。
（2）每孔加 500 μL RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）。
（3）37℃、50 mL/L CO2 培养箱培养 4 h。
（4）加入终浓度为 10 mg/L 的 LPS 和终浓度为 80 g/L 的 IFN-γ。
（5）37℃、50 mL/L CO2 培养箱中孵育 24 h，吸取 50 μL 上清于 96 细胞培养板中，按 Griess 试剂盒说明书进行检测，用酶标仪于波长 540 nm 检测 A 值。
（6）同时按 Griess 试剂盒说明书绘制标准曲线并计算得出各组产生的 NO 量。
7. 统计学分析：结果用 x±s 表示，n 为样本量。统计作图软件用 MicrosoftExcel。组向比较采用 One-way t 检验，P<0.05 为具有统计学意义。
材料与仪器
小鼠；
Sal、MTT、乙醇、DMSO、LPS、IFN-γ、H2DCFDA 染液、Griess 试剂盒；
酶标仪、流式细胞仪、荧光酶标仪；
步骤
一、材料准备
1. 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备
（1）将 BALB/c 小鼠眼球放血处死，用 750 mL/L 乙醇消毒小鼠皮肤后。
（2）腹腔注射 5 mL RPMI 1640 基础培养基。
（3）轻揉小鼠腹部 5 min，从侧腹壁小心抽吸出液体，收集细胞到 15 mL 的离心管中，于 4℃ 以 1500 r/min，离心 5 min，弃上清，用 RPMI 1640 基础培养基重悬，并将细胞密度调整为 2×109 个细胞 /L，接种到 96/24 孔细胞培养板中，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养。
（4）3 h 后弃上层培养液，用冷的 RPMI 1640 基础培养基轻轻洗涤 2 次，去除未贴壁细胞即得已贴壁的巨噬细胞。
（1）将 BALB/c 小鼠眼球放血处死，用 750 mL/L 乙醇消毒小鼠皮肤后。
（2）腹腔注射 5 mL RPMI 1640 基础培养基。
（3）轻揉小鼠腹部 5 min，从侧腹壁小心抽吸出液体，收集细胞到 15 mL 的离心管中，于 4℃ 以 1500 r/min，离心 5 min，弃上清，用 RPMI 1640 基础培养基重悬，并将细胞密度调整为 2×109 个细胞 /L，接种到 96/24 孔细胞培养板中，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养。
（4）3 h 后弃上层培养液，用冷的 RPMI 1640 基础培养基轻轻洗涤 2 次，去除未贴壁细胞即得已贴壁的巨噬细胞。
二、实验步骤
1. 对照实验
（1）实验设置空白对照组（加 DMEM 完全培养液）、对照组（加巨噬细胞悬液）、Sal 80 μmol/L 组、Sal 160 μmol/L 组和 Sal 320 μmol/L 组，每组设 3 个复孔。
（2）将取密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种于 96 孔板中，每孔添加 190 μL 的 RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 的 Sal 工作液，使其终浓度分别为 80 μmol/L、160 μmol/L 及 320 μmol/L，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养 48 h。
（3）每孔加入20 μL （质量浓度为 5 mg/L）MTT，避光孵育 4 h 后，离心（1500 r/min，5 min）弃上清，每孔加 100 μL 二甲基亚砜（DMSO），于振荡器上避光振荡 10 min 以溶解孔底紫色结晶，在酶标仪于 490 nm 波长检测各孔吸光度值，并计算细胞的相对存活率。
（4）细胞相对存活率 = [（不同浓度的 Sal 组的 A 值 - 空白对照组的 A 值）/（对照组的 A 值-空白对照组的 A 值）] × 100%。
2. 采用 MTT 比色法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组和 Sal+LPS+IFN-γ 组，每组设 3 个复孔。
（2）将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 96 孔板中，每孔添加 190 μL 的 RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）培养 4 h。
（3）加入 LPS（终浓度为 10 mg/L）和 IFN-γ（终浓度为 80 μg/L），于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中培养 48 h。
（4）每孔加入 20 μL 的 MTT（终浓度为 5 mg/L），继续培养 4 h 后离心（1500 r/min，5 min）。
（5）弃上清，每孔加入100 μL DMSO，震荡10 min，酶标仪于波长 490 nm 检测 A 值，并计算 Sal 对巨噬细胞的增殖促进率。
（6）促进率 = [（Sal+LPS+IFN-γ 组的 A 值 - LPS+IFN-γ 组的 A 值）/ LPS+IFN-γ 组的 A 值] × 100%。
3. 采用 Sytox Green 染色法检测
（1）实验设对照组、CHX 和 Sal+CHX 组，每组设 3 个复孔。
（2）将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 96 孔板中，添加 190 μL RPMI 1640 基础培养基，将 10 μL 终浓度为160 μmol/L 的 Sal 工作液加入到贴壁的巨噬细胞中。
（3）培养 4 h 后，在 CHX 组加入终浓度为 0.5 μmol/L 的CHX，继续于 37℃、50 mL/L CO2 孵箱中培养 48 h。
（4）加入终浓度为 0.5 μmol/L 的 Sytox Green 对 96 孔板中的巨噬细胞室温下染色 15 min，用荧光酶标仪检测巨噬细胞 Sytox Green 染色的荧光强度。
4. 采用免疫荧光微球法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组、不同浓度的 Sal 组和Sal+LPS+IFN-γ 组，每组设 3 个复孔。
（2）将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 24 孔培养板中，每孔加 500 μL RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）。
（3）37℃、50 mL/L CO2 培养箱 4 h。
（4）加入终浓度为 10 mg/L 的 LPS 和终浓度为 80 μg/L 的IFN-γ，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中孵育 24 h，最后加入直径为 1 μm 的荧光微球（终浓度为 1×1010/L），继续培养 2 h。
（5）轻轻吸掉上清，用 PBS 轻轻洗涤清除未吞噬的微球，然后用胰酶将贴壁的腹腔巨噬细胞消下来。
（6）收集细胞，离心（1500 r/min，5 min），用 200 μL PBS重悬后立即用 FCM 进行检测。
5. 采用 H2DCFDA 染色法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组和 Sal+LPS+IFN-γ 组，每组设 3 个复孔。
（2）按照密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 96 孔培养板中，每孔加入 190 μL 的 RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）。
（3）37℃、50 mL/L CO2 培养箱 4 h。
（4）加入终浓度为 10 mg/L 的 LPS 和终浓度为 80 μg/L 的IFN-γ，于 37℃、50 mL/L CO2 培养箱中孵育 24 h。
（5）弃上清，用终浓度为 5 μmol/L 的 H2DCFDA 染液，每孔加 100 μL 染液避光室温染色 30 min。
（6）用荧光酶标仪进行检测，其发射光波长为 485 nm，检测光波长为 520 nm。
6. 采用 Griess 试剂盒法检测
（1）实验设对照组、LPS+IFN-γ 组和 Sal+LPS+IFN-γ 组，将密度为 2×109 个细胞 /L 的腹腔巨噬细胞接种到 24 孔培养板中。
（2）每孔加 500 μL RPMI 1640 基础培养基，并加入 10 μL 不同浓度的 Sal（终浓度为 80、160、320 μmol/L）。
（3）37℃、50 mL/L CO2 培养箱培养 4 h。
（4）加入终浓度为 10 mg/L 的 LPS 和终浓度为 80 g/L 的 IFN-γ。
（5）37℃、50 mL/L CO2 培养箱中孵育 24 h，吸取 50 μL 上清于 96 细胞培养板中，按 Griess 试剂盒说明书进行检测，用酶标仪于波长 540 nm 检测 A 值。
（6）同时按 Griess 试剂盒说明书绘制标准曲线并计算得出各组产生的 NO 量。
7. 统计学分析：结果用 x±s 表示，n 为样本量。统计作图软件用 MicrosoftExcel。组向比较采用 One-way t 检验，P<0.05 为具有统计学意义。
常见问题
一、讨论
巨噬细胞免疫调节作用的发挥是通过其抗原提呈、吞噬作用和分泌多种细胞因子而实现的。巨噬细胞发挥其免疫功能的基础是细胞的存活，其存活状态直接影响着其功能的发挥及应答的强弱。
对细胞存活的保护作用一般从两个方面完成：一是促进细胞生长，二是抑制细胞凋亡。为此，本实验针对巨噬细胞设计了一系列的实验，结果发现，Sal能促进小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激下的增殖反应，提示Sal可能是作为次级信号对LPS和IFN-γ促进巨噬细胞的信号转导及细胞因子的分泌有协同作用，从而促进其增殖。因此提示，Sal可能对小鼠的固有免疫有增强作用。
本实验的结果表明，Sal对CHX诱导的细胞凋亡具有抑制作用。已知CHX是一种蛋白质合成抑制剂，可通过直接与蛋白转位酶结合，干扰转录过程从而抑制蛋白合成。故我们推测，Sal可能通过某些途径阻断了CHX与蛋白转位酶的结合进而抑制CHX诱导的细胞凋亡。
从上述两个实验结果中可以得出Sal对小鼠腹腔巨噬细胞的存活具有保护作用。吞噬功能是巨噬细胞的重要功能之一，巨噬细胞通过吞噬侵入的病原体及体内衰老、畸变的细胞而提高机体的抗感染能力。
巨噬细胞对病原体等抗原性异物的识别是通过其表面模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR）直接识别某些病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，或通过表面IgGFc受体（Fc??R）和补体受体（CR）识别IgG或补体结合的病原体。
巨噬细胞和病原体等抗原性异物结合后，经过吞噬或吞饮作用将病原体等摄入胞内形成吞噬体。在吞噬体内，可以通过氧依赖和氧非依赖的杀菌系统杀伤病原体。我们研究了Sal对巨噬细胞吞噬功能的影响，结果表明，Sal均能明显提高巨噬细胞在静息态和活化态的吞噬功能，推测Sal可能是通过某个分子结构或生物学机制，促进巨噬细胞表面的PRR和病原体或凋亡细胞表面的特定分子结构相结合，从而促进巨噬细胞的吞噬功能，增强巨噬细胞对于外来病原体的固有免疫反应。
Ryter等研究表明，ROS能够启动细胞的凋亡级联反应。细胞内过量ROS的产生不但与细胞的凋亡和坏死有关，并且也与许多缺氧相关的病理学疾病（例如局部缺血损伤和肿瘤）有着密切的关系。
对细胞存活的保护作用一般从两个方面完成：一是促进细胞生长，二是抑制细胞凋亡。为此，本实验针对巨噬细胞设计了一系列的实验，结果发现，Sal能促进小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激下的增殖反应，提示Sal可能是作为次级信号对LPS和IFN-γ促进巨噬细胞的信号转导及细胞因子的分泌有协同作用，从而促进其增殖。因此提示，Sal可能对小鼠的固有免疫有增强作用。
本实验的结果表明，Sal对CHX诱导的细胞凋亡具有抑制作用。已知CHX是一种蛋白质合成抑制剂，可通过直接与蛋白转位酶结合，干扰转录过程从而抑制蛋白合成。故我们推测，Sal可能通过某些途径阻断了CHX与蛋白转位酶的结合进而抑制CHX诱导的细胞凋亡。
从上述两个实验结果中可以得出Sal对小鼠腹腔巨噬细胞的存活具有保护作用。吞噬功能是巨噬细胞的重要功能之一，巨噬细胞通过吞噬侵入的病原体及体内衰老、畸变的细胞而提高机体的抗感染能力。
巨噬细胞对病原体等抗原性异物的识别是通过其表面模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR）直接识别某些病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，或通过表面IgGFc受体（Fc??R）和补体受体（CR）识别IgG或补体结合的病原体。
巨噬细胞和病原体等抗原性异物结合后，经过吞噬或吞饮作用将病原体等摄入胞内形成吞噬体。在吞噬体内，可以通过氧依赖和氧非依赖的杀菌系统杀伤病原体。我们研究了Sal对巨噬细胞吞噬功能的影响，结果表明，Sal均能明显提高巨噬细胞在静息态和活化态的吞噬功能，推测Sal可能是通过某个分子结构或生物学机制，促进巨噬细胞表面的PRR和病原体或凋亡细胞表面的特定分子结构相结合，从而促进巨噬细胞的吞噬功能，增强巨噬细胞对于外来病原体的固有免疫反应。
Ryter等研究表明，ROS能够启动细胞的凋亡级联反应。细胞内过量ROS的产生不但与细胞的凋亡和坏死有关，并且也与许多缺氧相关的病理学疾病（例如局部缺血损伤和肿瘤）有着密切的关系。
临床和体内实验均表明，红景天对局部缺血性损伤具有保护性作用。现在研究结果表明，Sal是红景天的主要活性成分，并能对缺氧造成的胞内过量ROS的产生而诱导的细胞凋亡具有保护性作用。Sal能清除机体内不同种类的超氧阴离子自由基和羟基自由基，因此，本实验研究了Sal对LPS和IFN-γ诱导的腹腔巨噬细胞胞内ROS产生的影响。
结果显示，Sal能显著降低活化巨噬细胞胞内的ROS，提示Sal的保护机制可能是直接清除腹腔巨噬细胞内的ROS，从而对过量ROS引起的腹腔巨噬细胞的凋亡起保护作用。
NO作为活化的巨噬细胞分泌的一种非特异性分子，能够杀灭或抑制多种病原微生物生长。巨噬细胞内的NO是通过NOS途径合成，其合成能力与抗炎作用密切相关。NO的合成可由IFN-γ所诱导，然而该诱导过程通常需要第二信号（TNF-及不同微生物成分如LPS）的存在。IFN-γ或第二信号单独作用时，可诱导巨噬细胞合成低量的NO，但在许多情形下，没有直接的细胞毒性作用；但IFN-γ和第二信号共同作用时，可显著提高NO的产生，并增加巨噬细胞的细胞毒性作用。
谢乐斯等研究表明，Sal免疫小鼠的腹腔巨噬细胞能显著提高杀伤HCa-F肝癌细胞的能力，推测Sal可能是通过iNOS介导的NO合成进而发挥杀瘤效应。
Seo等研究表明，Sal能促进IFN-γ活化的RAW264.7转录和表达iNOS基因，但Sal单独作用于静息的RAW264.7时，对iNOS基因的表达没有影响。
我们研究了Sal对腹腔巨噬细胞分泌NO的影响。结果表明，Sal对LPS和IFN-γ诱导活化的腹腔巨噬细胞分泌NO有协同作用，提示Sal可能是作为次级信号促进腹腔巨噬细胞中iNOS基因
的表达，从而促进腹腔巨噬细胞NO的产生，这可能是机体抗病原微生物和抗肿瘤作用的机制之一。
总之，Sal能增强巨噬细胞在静息态和活化态的吞噬功能，同时能促进NO的分泌并减少巨噬细胞胞内ROS的产生，且毒副作用小，提示其能提高整个机体固有免疫的功能，有可能成为肿瘤、感染、自身免疫病、免疫缺陷病等的辅助治疗药物，和使其成为一种很有前途的免疫调节剂。
来源：丁香实验
