请问退火温度如何选择？

55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

退火温度确定的计算公式是：4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8）。退火温度（AnnealingTemperature）是指引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。它是影响PCR特异性的较重要因素。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

在引物设计过程中，软件会计算出退火温度，引物合成后，在进行PCR时，可以围绕这个温度设计梯度，检测一下哪个温度下扩增特异性最好