简介
反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量的 RNA 样品分析成为可能。
原理
用途
反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
材料与仪器
器材:
①紫外分光光度计、紫外检测仪
②恒温水浴箱
③电泳仪、电泳槽
④PCR 仪
⑤0.5 ml 及1.5 ml Eppendorf 管(Ep 管)若干、20 μl 和 200 μl 吸头
⑥可调加样器(20 μl 和 200 μl 各 1 支)
试剂:
①材料:新鲜组织、培养细胞等 RNA 来源
②RNA 提取试剂
③DNA 分子质量标准(Marker,1 kb 梯度)
④琼脂糖、5 x TBE、TE
⑤oligo(dT)12~18、第一链 cDNA 合成试剂盒、10 x PCR 缓冲液
⑥dNTP 混合物(含等量 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)
⑦无水乙醇
⑧Taq DNA 聚合酶
⑨DEPC 处理水、双蒸水(ddH2O)、灭菌水
步骤
反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的基本过程可分为如下几步:
1.总 RNA 的提取
(1)取已从活体上取下的组织约 1.5 g 置冰上,剪成 1 mm3 小块,加 5 ml 预冷的变性液,迅速匀浆 15~30 s。
(2)转移入 15 ml 离心管中,加 1 ml 2 mol/L 乙酸钠(pH4.0),翻转混合。
(3)加 1 ml 氯仿[氯仿-异戊醇(49:1)],翻转混合,猛烈振摇 10 s,冰浴 15 min。
(4)4℃ 离心(10000 g × 20 min)。
(5)将上层水相移入新 15 ml 离心管,加 2 倍体积冷无水乙醇,置 -20℃ 保持 1 h 以上。
(6)4℃ 离心(10000 g × 20 min)。
(7)弃上清液,加 2 ml 变性液重悬沉淀。
(8)转入新管,加 2 倍体积冷乙醇置 -20℃ 沉淀 1 h 以上。
(9)4℃ 离心(10000 g × 20 min)。
(10)沉淀用 70% 乙醇洗 1 次。
(11)空气干燥,沉淀溶解在 100 μl DEPC 处理水中,-70℃ 贮存。
2.cDNA 第一链的合成
(1)反应体系:在 0.5 ml 微量离心管中,加入总 RNA,1~5 μg;10 μmol/L oligo(dT)12~18,1 μl;补充适量的DEPC处理水,使总体积达 12 μl。轻轻混匀,稍离心。
(2)65℃ 加热 5 min,立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min。
(3)然后加入下列试剂的混合物 5x 反转录缓冲液,4 μl,12.5 mmol/L dNTP,1 μl。补充适量的 DEPC 处理水,使总体积达 19 μl。轻轻混匀,稍离心。
(4)65℃ 孵育 2~5 min。
(5)加入 MMLV 反转录酶 1 μl(200 U),混匀,稍离心。
(6)在 37℃ 水浴中孵育 60 min。
(7)于 95℃ 加热 5 min 以终止反应。
(8)-20℃ 保存备用。
3.PCR
(1)取 0.5 ml PCR 管,依次加入第一链 cDNA,2 μl;上游引物(10 pmol/L),2 μl;下游引物(10 pmol/L),2 μl。
dNTP(2 mmol/L),4 μl; 10x PCR 缓冲液,5 μl;Taq 酶(2U/μl),1 pl;加入适量的 ddH2O,使总体积达 50 μl。
(2)轻轻混匀,稍离心。
(3)设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28~32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在 PCR 扩增目的基因时,加入 1 对内参(如 β-肌动蛋白)的特异性引物,同时扩增内参 DNA,作为对照。
(4)电泳鉴定,进行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
4.实验结果及分析
采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行灰度扫描,用 β-肌动蛋白条带的灰度对目的条带的灰度进行校正(目的条带灰度/β-肌动蛋白条带灰度),得到目的条带的半定量结果。
注意事项
(1)在实验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中,注意避免 mRNA 的断裂。
(2)为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。
(3)内参的设定,主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G-3-PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-肌动蛋白等。
其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。
(4)PCR 不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。
(5)防止 DNA 的污染 ①采用 DNA 酶处理 RNA 样品;②在可能的情况下,将 PCR 引物置于基因的不同外显子,以消除基因和 mRNA 的共线性。
(6)目前试剂公司有多种 RNA 提取试剂盒、cDNA 第一链试剂盒、PCR 试剂盒以及 RT-PCR 试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。
如果使用试剂盒,具体操作步骤请参照试剂盒说明书。
来源:丁香实验