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定性 PCR 实验

实验分类:

PCR 技术

最新修订时间:

简介

PCR 是指在 DNA 聚合酶催化下,以亲代 DNA 为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸三步骤循环,在体外复制出与模板 DNA 序列互补的子链 DNA 的过程,能快速特异地在体外扩增任何目的 DNA 片段。定性、半定量和定量 PCR 技术在生物学和医学中的应用极其广泛,目前,定性 PCR 的方法主要有原位 PCR 和反向 PCR 等。

原理

PCR 的基本作用原理是在体外模拟体内 DNA 复制的过程,以拟扩增的 DNA 分子为模板;用 2 个寡核苷酸片段作为引物,分别在拟扩增片段的 DNA 两侧与模板 DNA 链互补结合,提供 3'- 0 H 末端;在 DNA 聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA 合成,不断重复这一过程,即可使目的 DNA 片段得到扩增。PCR 反应的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。图解示意如下所示:



来源:丁香通实验团队

操作方法

原位 PCR 实验

原位 PCR 是直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在完整细胞中进行 PCR 扩增的方法。原位 PCR 是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段。在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。原位 PCR 既能分辨鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程有重大的实用价值,其特异性和敏感性高于一般的 PC

反向 PCR 实验

反向 PCR 又称染色体缓移或染色体步移,可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知 DNA 片段的序列,并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆,建立全长的 DNA 探针。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列。方法原理反向 PCR 的基本原理是选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补,但两引物 3 ’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA

反转录-聚合酶链反应

反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量的RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

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