反向 PCR 实验

反向 PCR 又称染色体缓移或染色体步移，可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知 DNA 片段的序列，并可将仅知部分序列的全长 cDNA 进行分子克隆，建立全长的 DNA 探针。反向 PCR 可用于研究与已知 DNA 区段相连接的未知染色体序列。

方法原理

反向 PCR 的基本原理是选择的引物虽然与核心 DNA 区两末端序列互补，但两引物 3 ’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品 DNA，然后用 DNA 连接酶连接成一个环状 DNA 分子，通过反向 PCR 扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状 DNA 片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上 DNA 片段序列的识别十分重要。

方法应用

反向 PCR 可用于：

（1）基因游走研究；

（2）转位因子研究；

（3）已知序列 DNA 旁侧病毒整合位点分析等研究。

反向 PCR 的基本过程可分为如下几步：

一、限制性内切酶消化

1. 选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组 DNA 定量。

2. 根据 T-DNA 的左边界序列选择合适的酶切位点 EcoRI，BamHI 和 HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物 Z1，Z2，Z3 和 Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组 DNA，37℃ 过夜，电泳检测酶切效果。
   

二、回收 DNA

1. 将酶切产物转到 1.5 ml 离心管中，用 ddH₂O 洗涤干净，并稀释到 250 ul；

2. 加入等体积的酚和氯仿（V：V = 1：1），涡旋混匀，室温静置 1 min；

3. 最大速度（13 000 rpm）离心 1 min；

4. 将上清移到另一管中，加入等体积的氯仿，涡旋混匀，室温静置 1 min；

5. 最大速度（13 000 rpm）离心 2 min；

6. 将上清移到另一管中，加入 2.5 倍体积的- 20℃ 预冷的无水乙醇，0.1 倍体积的 3 M 乙酸钠（pH = 5.2），轻轻振荡混匀，室温静置 5 min；

7. 4℃ 最大速度（13000 rpm）离心 10～15 min；

8. 弃上清，尽量除去管壁上的液体；

9. 加入 1 ml - 20℃ 预冷的 70% 乙醇，轻轻颠倒几次。最大速度（13 000 rpm）离心 5 min；

10. 除去乙醇，在超净台上平放，将管壁上的乙醇挥发掉，20～40 ul ddH₂O 溶解。- 20℃ 保存。
    

三、连接

1. 连接体系 2 - 14℃，过夜连接完成后，65℃ 水浴 10 min 灭活。抽提回收，溶解于 40ul ddH₂O 中。

2. 回收的链接片段做 PCR。
   

注意事项