原位 PCR 实验

原位 PCR 是直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在完整细胞中进行 PCR 扩增的方法。原位 PCR 是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段。在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。原位 PCR 既能分辨鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，在分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程有重大的实用价值，其特异性和敏感性高于一般的 PCR。

方法原理

原位 PCR (In Situ PCR，IS-PCR) 的基本原理是一种把原位杂交的细胞定位技术与 PCR 的高灵敏度相结合的技术，即通过 PCR 技术以 DNA 为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定量定位分析。

方法应用

原位 PCR 技术的常用领域如下：
可应用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片以及石蜡切片。相比较而言，以悬浮的完整细胞做原位 PCR 效果最好，石蜡切片效果最差。

（一）标本的制备：

组织细胞的固定 一般认为组织细胞以 10% 的缓冲福尔马林或 4% 的多聚甲醛固定后进行原位 PCR 效果较好。固定的时间一般不宜过长，视组织的大小，一般以 4℃4 - 6 小时为宜。

切片的厚度 一般而言，切片若厚一些，原位 PCR 的效果也较好一些，因为切片越厚，靶 DNA 的含量也就越多，同时膜结构也较多，防止扩增产物弥散的作用也越明显。但厚切片细胞重叠多，形态学观察的效果就差了，分辨率也将下降。

玻片的处理 为防止石蜡切片在 PCR 和原位杂交过程中脱落，在玻片应作防脱片处理，常用的方法是涂以多聚赖氨酸或用硅烷化处理，一般能防止组织脱落。

（二）原位扩增（PCR）：

原位扩增即在组织细胞标本上进行 PCR 反应，其基本原理与液相 PCR 完全相同。

引物 PCR 所用的引物一般为 15 - 30bp 为宜，扩增的片断为 100 - 1000bp 左右。

反应体系 原位 PCR 的反应体系与常规的液相 PCR 基本相同，由于是在经过固定的组织切片上进行，为获得较好的扩增效果，有人主张反应体系中的引物，TaqDNA 聚合酶以及 Mg²⁺的浓度均应高于液相的 PCR 反应体系。在反应体系中要加入牛血清白蛋白（BSA）, 以防止 TaqDNA 聚合酶与玻片的结合而降低了扩增效率。

热循环 原位 PCR 的热循环可在专门的热循环仪上进行，操作简便。也可在一般的 PCR 热循环仪上进行，通常在样品台上覆盖一层铝箔，制成平台，样品台上的空间用矿物油或水充填，将载玻片至于平台上，即可进行热循环的步骤。

（三）原位检测：

注意事项：

原位 PCR 操作过程中的注意事项有以下几点：

1. 蛋白酶消化的程度就要根据组织固定的程度进行调整。蛋白酶消化后，要注意加热以灭活酶的活性或通过充分的洗涤将酶完全去除，因为只要有少量的残留酶存在，都将对随后进行的 PCR 反应体系的数量 TaqDNA 酶产生毁灭性的影响。

2. 原位 PCR 宜用较短的引物。从石蜡切片中提取的 DNA 很少超过 400bp，RNA 很少超过 200bp，较长序列的扩增易引起引物与模板的错配而导致非特异性反应的出现。

3. 为了保证进行充分的扩增，原位 PCR 热循环中每一步骤的时间可比常规 PCR 略长些，另外，也可采用热启动（hot start）的方法，即玻片加热到 80 - 94℃ 时，再立即加入 TaqDNA 聚合酶。

4. 为了保证反应体系在热循环过程不过多丢失，可用清亮的指甲油，矿物油或 PAP 笔把盖片四周封闭起来。

5. 在扩增后用 4% 多聚甲醛 2 小时或 2% 戊二醛 5 分钟进行后固定，以使扩增的产物在检测时能很好地保留在细胞内，提高检测的敏感性和特异性。
   

常见问题及解决方案

常见问题：PCR 效率不高

可能原因 1：玻片上做 PCR，热传导较差，热对流不均匀，TaqDNA 酶被玻璃片吸附等；