间接原位PCR（原位杂交PCR）

与直接原位PCR所不同的是，靶基因在扩增时不进行标记基团的掺入，而是标记一段与扩增片段互补的探针，在扩增结束后，应用此探针进行原位杂交。因此，此处主要介绍原位杂交，其余方法同原位PCR。

一、预杂交

1. 试剂与配制

2×SSC

50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）

预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉

2. 操作方法

① 在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15min；

② 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15min；

③加预杂交液20μl/片，在杂交温度下孵育30min～2hr。

二、杂交

1. 试剂与配制

杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10mg/ml变性的鲑鱼精DNA

2. 操作方法

① 弃预杂交液，加杂交液（含0.2～5μg/ml探针）10～20μl/片，覆盖经硅化的盖玻片，石蜡膜封片或橡皮泥封片；

② 玻片置于湿盒中，42℃杂交12～18hr（过夜，但不能超过24hr）。

2. 注意事项

① 如果检测mRNA，双链探针应变性处理，方法是95～100℃加热10min后迅速置于冰中骤冷；

② 以单链探针检测DNA时，DNA也需变性处理，将玻片置于70～80℃变性液（70%去离子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10min；

③ 用双链探针检测DNA时，可按上述方法变性处理。

三、杂交后处理

1. 试剂与配制

2×SSC

Rnase（20μg/ml）

50%去离子甲酰胺

10mmol/L DTT

2. 操作方法

① 杂交完毕，用2×SSC浸泡玻片数分钟，轻轻移去盖玻片，再用2×SSC洗玻片1～2min；

② 2×SSC（含20μg/ml RNase，适宜RNA探针，DNA探针可省略此步）中洗片30min，37℃；

③ 2×SSC/50%去离子甲酰胺，42℃×10min；

④1×SSC/50%去离子甲酰胺，37℃×30min，2次；

⑤ 4×SSC/10mmol/L DTT洗1hr；

⑥ 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30min；

⑦ PBS中洗10min，即可进行显色，方法同上。