反转录－聚合酶链反应

反转录－聚合酶链反应 (reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR ) 将 RNA 的反转录反应与 PCR 反应相结合，是最广泛使用的 PCR 方法。

方法原理

RT-PCR 的基本原理是以 RNA 为模板，用反转录酶合成 cDNA 链，再以 cDNA 为模板，通过 PCR 扩增合成目的 DNA 片段。RT-PCR 可检测到单个细胞中少于 10 个拷贝的特异 RNA, 是目前敏感度最高的 RNA 检测方法，可以用于低丰度的 mRNA 分析，克服了原有的原位杂交、点杂交、RNA 印迹杂交及核酸酶保护实验等 RNA 分析方法的局限。

方法应用

RT-PCR 可检测到单个细胞中少于 10 个拷贝的特异 RNA, 是目前敏感度最高的 RNA 检测方法，可以用于低丰度的 mRNA 分析。

（一）动物组织/细胞总 RNA 的抽提及检测 (TRizol 法）:

A. 取新鲜动物组织 0.1～0.2 g 置于研钵中，用剪刀剪碎组织，研钵中加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，成粉末状，每 100 mg 组织加入 1 ml TRizol, 在冰浴中迅速匀浆 15～30s, 以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一微量离心管中，室温下静置 5 min。

B 若为贴壁细胞，培养预定时间后，彻底弃掉培养液。将 TRizol 试剂直接加在贴壁细胞上，室温放置 10 min; 若为悬浮培养细胞，则直接离心收集细胞后用 TRizol 重悬、裂解，每 1 ml TRizol 可裂解 5 * 10⁶ 个动物、植物或酵母细胞，或 1 * 10⁷ 个细菌菌体。

C 反复吹打裂解组织/细胞，裂解液移入新管，室温静置 5 min，4℃、12000 g 离心 10 min。

D 将上清转移入新管，按照 TRizol: 氯仿等于 5 : 1 的比例加入氯仿 200μL，用力颠倒充分混匀，静置 10 min, 待其分层后，4℃、12000 g 离心 15 min。

E 小心转移水相至新管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，室温放置 10 min, 4℃、12000 g 离心 10 min, 小心弃上清。

（二）RT-PCR 反应:

A. 反转录

注意事项

RT-PCR 实验过程中的注意事项有以下几点：

1. 提取获得的 RNA 用琼脂糖凝胶甲酸变性电泳分析其完整性。

2. RT-PCR 实验的成败在很大程度上取决于 RNA 的纯度和完整性。利用动物组织/细胞提取 RNA 时，要利用高浓度的蛋白质变性剂以及酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使 RNA 与其他细胞组分分离。在提取的过程中要抑制内源和外源的 RNA 酶 ( RNase) 活性，保护 RNA 分子不被降解。

3. PCR 扩增的 DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳来分辨和检测, 并可使用 Total Lab 软件进行灰度分析，以目的基因与内参基因灰度的比值表示 mRNA 的相对水平。

4. RT-PCR 中的关键步骤是 RNA 的反转录，然后核糖核酸酶 H ( RNaseH ) 催化 DNA-RNA 杂合体的 RNA 部分降解。未除净的蛋白质可与 RNA 结合从而影响反转录和 PCR 反应。若 RNA 模板中污染了微量 DNA, 扩增后会出现非特异 DNA 的 PCR 产物。

常见问题及解决方案