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反转录-聚合酶链反应

相关实验:定性 PCR 实验

最新修订时间:

简介

反转录-聚合酶链反应 (reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR ) 将 RNA 的反转录反应与 PCR 反应相结合,是最广泛使用的 PCR 方法。


方法原理


RT-PCR 的基本原理是以 RNA 为模板,用反转录酶合成 cDNA 链,再以 cDNA 为模板,通过 PCR 扩增合成目的 DNA 片段。RT-PCR 可检测到单个细胞中少于 10 个拷贝的特异 RNA, 是目前敏感度最高的 RNA 检测方法,可以用于低丰度的 mRNA 分析,克服了原有的原位杂交、点杂交、RNA 印迹杂交及核酸酶保护实验等 RNA 分析方法的局限。


方法应用


RT-PCR 可检测到单个细胞中少于 10 个拷贝的特异 RNA, 是目前敏感度最高的 RNA 检测方法,可以用于低丰度的 mRNA 分析。

材料与仪器

试剂:
模板 RNA、逆转录酶和引物

仪器:
PCR 仪

步骤

RT-PCR 的基本过程可分为以下几步:

(一)动物组织/细胞总 RNA 的抽提及检测 (TRizol 法):


A. 取新鲜动物组织 0.1~0.2 g 置于研钵中,用剪刀剪碎组织,研钵中加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,成粉末状,每 100 mg 组织加入 1 ml TRizol, 在冰浴中迅速匀浆 15~30s, 以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一微量离心管中,室温下静置 5 min。

B 若为贴壁细胞,培养预定时间后,彻底弃掉培养液。将 TRizol 试剂直接加在贴壁细胞上,室温放置 10 min; 若为悬浮培养细胞,则直接离心收集细胞后用 TRizol 重悬、裂解,每 1 ml TRizol 可裂解 5 * 106 个动物、植物或酵母细胞,或 1 * 107 个细菌菌体。

C 反复吹打裂解组织/细胞,裂解液移入新管,室温静置 5 min,4℃、12000 g 离心 10 min。

D 将上清转移入新管,按照 TRizol: 氯仿等于 5 : 1 的比例加入氯仿 200μL,用力颠倒充分混匀,静置 10 min, 待其分层后,4℃、12000 g 离心 15 min。

E 小心转移水相至新管中,加入等体积异丙醇,振荡混匀,室温放置 10 min, 4℃、12000 g 离心 10 min, 小心弃上清。

F 向沉淀中加入 75% 乙醇,振荡片刻,以 4℃ 、7500 g 离心 5 min, 小心弃上清。室温静置 5~15 min, 使 RNA 沉淀恰好干燥,以 DEPC 水溶解,保存于- 70℃ 冰箱中备用。

(二)RT-PCR 反应:

A. 反转录

在微量离心管中加入模板 RNA 2 µg, Oligo(dT)18 (0.1 µg/ µl) 5µl,10 mmol/L dNTP 2 µl, DEPC 水补足体积至 14µl, 65℃ 水浴 5 min, 立即放到冰上,顺序依次加入:
5 *M-MLV 反应缓冲液 4µl
核酸酶抑制剂 (25U/µl) 1µl
M-MLV 反转录酶 (100U / µl ) 1µl
37℃ 孵育 60 min 。

B. PCR 反应
反转录产物(模板)2µl
10X PCR 反应缓冲液 5µl
10 mmol/L dNTP 4µl
引物 (50µmol/L) 1µl
Taq 酶 (5U / µl ) 0.5µl
DEPC 水 37.5µl
扩增程序:94℃ 5 min 热启动; 94℃ 45s,57℃ 30s,72℃ 1 min, 30 个循环; 72℃ 10 min。

注意事项

注意事项


RT-PCR 实验过程中的注意事项有以下几点:

  1. 提取获得的 RNA 用琼脂糖凝胶甲酸变性电泳分析其完整性。

  2. RT-PCR 实验的成败在很大程度上取决于 RNA 的纯度和完整性。利用动物组织/细胞提取 RNA 时,要利用高浓度的蛋白质变性剂以及酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使 RNA 与其他细胞组分分离。在提取的过程中要抑制内源和外源的 RNA 酶 ( RNase) 活性,保护 RNA 分子不被降解。
  3. PCR 扩增的 DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳来分辨和检测, 并可使用 Total Lab 软件进行灰度分析,以目的基因与内参基因灰度的比值表示 mRNA 的相对水平。

  4. RT-PCR 中的关键步骤是 RNA 的反转录,然后核糖核酸酶 H ( RNaseH ) 催化 DNA-RNA 杂合体的 RNA 部分降解。未除净的蛋白质可与 RNA 结合从而影响反转录和 PCR 反应。若 RNA 模板中污染了微量 DNA, 扩增后会出现非特异 DNA 的 PCR 产物。


常见问题及解决方案


常见问题 RNA 分子易降解:提取必须在无 RNase 的环境中进行,配制 RNA 提取试剂要用焦碳酸二乙酯 (diethypyrncarbonate, DEPC) 处理过的水以去除残余的 RNA 酶。

来源:丁香实验

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