反转录 PCR 的原理及应用
丁香实验团队
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1. 原理
RT—PCR 是一种将 cDNA 合成与 PCR 技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析, 还可以用来检测基因表达差异而不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。
RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(A) 选择性 RNA 。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT) 或基因特异性的引物（GSP）起始。
在实际应用中，RT—PCR 又常常分为一步法 RT—PCR 和两步法 RT—PCR。
2. 特点
一步法 RT—PCR 反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA 二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了 PCR 反应的错配率。而在两步法中，反应的精确度高，人为的误差相对较小，并且由于在第一步中将 RNA 反转录为 cDNA，从而更易于保存。
另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。传统检测方法的样品用量一般在 ug 级，而在 RT—PCR 检测系统中样品用量陡降至 pg 级。这就在很大程度上降低了实验操作的难度，特别是 mRNA 样品制备的过程得以简化。
3. 应用
对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法，如 Northern 杂交、斑点杂交（RNA dot）等而言，RT—PCR 的精确度更高，且样品用量显著减少。利用 RT—PCR 对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。
另外，还能同时分析多个差别基因的转录。在植物方面，RT—PCR 常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。
对基因转录中剪切与拼接的检测：如果 RT—PCR 引物确定了 mRNA 片段，根据其是否包含某个外显子，将产生两种差别 DNA 片段，进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的 DNA 序列及转座酶识别位点，用 RT—PCR 方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。
