原位PCR的反转录

原位PCR的反转录不同于原位PCR的过程包括两个：即蛋白酶消化后用无RNA酶的DNA酶消化过夜和原位PCR的反转录过程。此处主要介绍这两个过程，其余方法同原位PCR。

1．DNA酶消化

【试剂与配制】

无RNA酶的DNA酶

10×缓冲液：35μl 3mol/L NaAc，5μl 1mol/L MgSO₄，60μl DEPC水

【操作方法】

① 在蛋白酶处理过的玻片上加入1μl 10×缓冲液，1μl无RNA酶的DNA酶（10U/μl），8μl DEPC水；

② 用一个灭菌的聚丙烯塑料封条盖住溶液以防蒸发，将载玻片置于37℃的湿盒内；

③ 消化过夜，除去封条，用DEPC水洗1min，再用无水乙醇洗，空气干燥。

2．反转录

【操作方法】

① 在DNA酶消化的切片上，加入下列溶液：2μl 25mmol/L MgCl₂，1μl RT缓冲液，1μl 10mmol/L dNTP，1.5μl DEPC水，0.5μl 20μmol/L 3’端引物，0.5μlRNA酶抑制剂，0.5μl反转录酶；

② 用一滴指甲油固定封条以防蒸发，将载玻片放入PCR仪的加热板上，盖上矿物油，42℃反应30min；

③ 出掉封条，二甲苯洗5min除油，用无水乙醇洗5min，空气干燥；即可进行PCR扩增，方法同上。