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反向PCR (inverse-PCR)实验步骤

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inverse-PCR是克隆插入片段侧翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假阳性太多,而Inverse-PCR一般只要有特异条带,基本上就是目的片段。

基本步骤如下:

1、反向PCR(Inverse PCR)原理:反向PCR是克隆T-DNA插入位点侧翼DNA序列非常有效的方法。

a. 选择合适的限制性内切酶位点。并在T-DNA的边界(左边界、右边界均可)和酶切位点附近设计引物P1、P2;

b. 回收DNA,T4连接酶连接,使酶切后的DNA片段环化;

c. 回收连接后的DNA,用引物P1、P2做PCR,就可扩增到两端为T-DNA插入序列,中间为侧翼序列的片段。

2、限制性内切酶消化:选择合适的限制性内切酶,基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前,应对基因组DNA定量。

根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI,BamHI和HindIII/PstI,并在酶切位点上游附近设计引物Z1,Z2,Z3和Z4,然后用这些内切酶分别消化基因组DNA,酶切体系如下:

Buffer for EcoR I 2μl
Genomic DNA 3μl
EcoR I 0.5μl (10u/μl)
ddH2O 14.5 μl
20μl

37度 过夜,电泳检测酶切效果。

3、回收DNA

① 将酶切产物转到1.5ml离心管中,用ddH2O洗涤干净,并稀释到250μl;

② 加入等体积的酚和氯仿(V:V=1:1),涡旋混匀,室温静置1min;

③ 最大速度(13, 000 rpm)离心1min;

④ 将上清移到另一管中,加入等体积的氯仿,涡旋混匀,室温静置1min;

⑤ 最大速度(13, 000 rpm)离心2min;


⑥ 将上清移到另一管中,加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,0.1倍体积的3M 乙酸钠(pH=5.2),轻轻振荡混匀,室温静置5min;

⑦ 4℃最大速度(13, 000 rpm)离心10~15min;

⑧ 弃上清,尽量除去管壁上的液体;

⑨ 加入1ml -20℃预冷的70%乙醇,轻轻颠倒几次。最大速度(13, 000 rpm)离心5min;

⑩ 除去乙醇,在超净台上平放,将管壁上的乙醇挥发掉,20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。

4、连接。体系如下:

DNA 2μl
10×buffer 10μl
T4 ligase  1μl
ddH2 87μl
  100μl 

12-14℃   overnight

连接体系比较大,而DNA含量比较低,不需加入PEG4000,这样可以促进分子内的连接,减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等(2002)的方法(12-14℃连接48h)。连接完成后,65℃ 水浴10min灭活。按上述3.抽提回收,溶解于40μl ddH2O中。

然后就可以用回收的链接片段做PCR了。

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