AFLP-PCR实验

AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。

DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5 μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化，首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次.

离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置2 h以上，10000 g 离心10 min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，风干后溶于30 μl TE缓冲液中，UV-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5 μg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300 ul，此时DNA浓度大约为100 ng/ul。

在0.2 ml 离心管中加入：模板量约为250 ng，2.5 μl 10×酶切缓冲液， 2.5 μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5 U EcoRⅠ， 5 U MseⅠ，2 U T4连接酶，50 pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25 μl。用PE公司PCR扩增仪设定37℃过夜反应后，于65℃20 min灭酶活，-20℃保存，作为预扩增模板。

取释稀后的产物3 μl，加入EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各75ng，15 mmol/L Mg2+，25 mmol/L dNTPs，1 UTag酶，3 μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30 μl。

反应参数为：94℃90 s；94℃30 s，65℃1 min，72℃1 min，13循环（每循环降0.7℃）；94℃30 s， 56℃1 min，72℃1 min，25循环；72℃5 min，先用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5 μg/ml）电泳检测先择性扩增产物。

扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度0.5 mm）和1×TBE电泳缓冲液电泳分离。拔出梳子，140 W 恒功率预电泳30分钟，温度达到47～49℃。务必使每个孔清洗出尿素。

选择性扩增产物中加入等体积上样缓冲液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性5 min，结束后迅速置于冰上直到点样。每个泳道加样8 μl。一开始用100 W 恒功率电泳约2分钟，使样品迅速集中到孔底部，再调到60W恒功率电泳，温度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3处，结束电泳。

（7）去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用Nikon数码相机拍照。