分子标记—AFLP

AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。

DNA样品
Taq酶 EcoRI MseIEcoRI MseI接头 E+A引物M+C引物 T4DNALigaseE和M引物 琼脂 过硫酸胺 丙烯酰胺 尿素 硝酸银 甲酰胺 dNTPs 二甲苯青 冰醋酸 玻璃硅烷 50bpMark
电泳仪 离心机 Eppendorf管 凝胶成像仪 紫外分光光度计 37℃水浴锅 PCR仪

一、基因组DNA提取和纯化

1. 大量提取DNA（实验方法视DNA来源而异，此处略）。

2. DNA的纯化：

（1）用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化。

（2）首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次。

（3）离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，——20℃放置2h以上。

（4）10000xg离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，风干后溶于30μl TE缓冲液中。

（5）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。

二、限制性酶切及连接

1. 在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸水补至25μl。

2. 用PCR扩增仪设定37℃过夜反应后，于65℃，20min灭酶活，——20℃保存，作为预扩增模板。

三、预扩增

1. 取3μl酶切连接产物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。

反应参数为：94℃ 90s；94℃ 30s，56℃ 1min，72℃ 1min，30循环；72℃ 10min。

2. 反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测扩增产物，取3μl产物释稀50倍，用作选择性扩增模板。

四、选择性PCR扩增

1. 取释稀后的产物3μl，加入EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各75ng，15 mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。

反应参数为：94℃ 90s；94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 1min，13循环（每循环降0.7℃）；94℃ 30s， 56℃ 1min，72℃ 1min，25循环；72℃ 5min.

2. 反应结束后，用0.8%琼脂糖凝胶（含EB 0.5μg/ml）电泳检测先择性扩增产物。

五、凝胶电泳

1. 扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度0.5mm）和1×TBE电泳缓冲液电泳分离）。拔出梳子，140W恒功率预电泳30分钟，温度达到47——49℃。务必使每个孔清洗出尿素。

2. 选择性扩增产物中加入等体积上样缓冲液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性5 min，结束后迅速置于冰上直到点样。

3. 每个泳道加样8μl。一开始用100W恒功率电泳约2分钟，使样品迅速集中到孔底部，再调到60W恒功率电泳，温度保持在43℃左右，待二甲苯青泳动至玻璃板2/3处，结束电泳。

六、银染

1. 固定液配制：取100ml冰醋酸到900ml去离子水或双蒸水中。

染色液：1g AgNO₃，1.5ml 37% 甲醛，加去离子水至1L。

显色液：30g Na₂CO₃，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸钠，加去离子水至1L。

2. 具体操作流程

（1）电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中。

（2）固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡30min。固定结束后，固定液保留。

（3）加入去离子水漂洗3次，每次2min。

（4）染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），在摇床上轻微震荡30min。用去离子水漂洗凝胶10秒钟后，置入显色盘中。

（5）显色：加入显色液（4℃），在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止。

（6）终止：加入（2）步骤用后的固定液，来回漂几分钟。达到最好效果后，用蒸馏水漂洗几分钟。

（7）去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用数码相机拍照。

七、数据分析

用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计，再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。