PCR 反应体系的循环参数

1、变性温度和时间：

模板 DNA 和 PCR 产物的变性不充分是 PCR 失败的主要原因。适宜的变性条件是 95℃ 30s 或 97℃15s。变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，会导致酶活性的损失。Taq DNA 聚合酶活性的半寿期：92.5℃为 2h 以上，95℃为 40min，97℃为 5min。

2、复性温度和时间：

复性温度决定 PCR 的特异性，而引物退火温度和所需时间长短取决于反应体系中的基本组成及扩增引物的长度和浓度，实际使用的退火温度要比扩增引物的 Tm 值低 5℃。增加退火温度会增加引物的识别，同时可降低引物 3 端核苷酸的错误延伸。因此，提高退火温度，特别是在前几个循环中，会增加扩增的特异性。而且为了在循环开始获得最高的特异性，应在第一次变性之后，引物退火之前加入 Taq DNA 聚合酶。复性时间一般为 30～60s。

3、延伸温度和时间：

引物延伸温度一般为 72℃，延伸的时间决定于扩增模板的长度，小于 1kb 的片段一般 1～2min，而 10kb 的片段可能需要 15min 或更长时间。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，亦会影响其产量。

4、循环数：

在 25～30 个循环内，扩增 DNA 增加明显，需要进一步增加产量时，可将第一次 PCR 产物稀释后再扩增，而不要盲目增加循环数，以免增加非特异扩增。