PCR
最新修订时间：
原理
PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异DNA片段得到大量扩增。
材料与仪器
转基因水稻叶片 DNA 引物
矿物油 MgCl2 Primer dNTP 水 溴酚蓝 琼脂糖凝胶 EB
离心机 电泳仪 紫外检测仪
矿物油 MgCl2 Primer dNTP 水 溴酚蓝 琼脂糖凝胶 EB
离心机 电泳仪 紫外检测仪
步骤
1. 调整模板浓度至10 ng/ml
2. 按下列体系配制反应混合液，混匀，加一滴矿物油，离心5秒
Template DNA （20 ng）2
buffer 2.0 ´10 μl
MgCl2（25 mM） 1.5 μl
lmPrimer F (10 mM) 0.2 μl
Primer R (10 mM) 0.2 μl
lmdNTPs（2 mM） 2.0 μl
Taq（5 U/μl） 2.0 μl
Add ddH2O to 20 μl
3. PCR反应循环条件设置：
95 ℃ 1 cycle
94 ℃ 55 ℃ 1' 72 ℃ 1'30" 35 cycles
72 ℃ 1 cycle
4 ℃ forever
溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15 ml
4. 检测：加2 ml反应产物点样电泳；
5. 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
2. 按下列体系配制反应混合液，混匀，加一滴矿物油，离心5秒
Template DNA （20 ng）2
buffer 2.0 ´10 μl
MgCl2（25 mM） 1.5 μl
lmPrimer F (10 mM) 0.2 μl
Primer R (10 mM) 0.2 μl
lmdNTPs（2 mM） 2.0 μl
Taq（5 U/μl） 2.0 μl
Add ddH2O to 20 μl
3. PCR反应循环条件设置：
95 ℃ 1 cycle
94 ℃ 55 ℃ 1' 72 ℃ 1'30" 35 cycles
72 ℃ 1 cycle
4 ℃ forever
溴酚蓝，混匀，短暂离心，取15 ml
4. 检测：加2 ml反应产物点样电泳；
5. 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。
注意事项
1. PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。
2. DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
3. PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
4. PCR操作应戴手套并勤于更换。
5. 成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
6. 试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
7. 最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
8. 实验设阳性、阴性对照。
来源：丁香实验
