PCR反应体系与反应条件

标准的 PCR 反应体系：

　　　　　　 10 ×扩增缓冲液 　 10ul

　　　　　　 4 种 dNTP 混合物 　 各 200umol/L

　　　　　　 引物 　　　　 　 各 10 ～ 100pmol 　

　　　　　　 模板 DNA 　　　 　 0.1 ～ 2ug 　

　 　　　　　 Taq DNA 聚合酶 　 2.5u 　

　　　　　　 Mg2+ 　　　　　　 1.5mmol/L

　　　　　　 加双或三蒸水至 　 100ul

　　 PCR 反应五要素 ： 参加 PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg2+

引物 ： 引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp ，常用为 20bp 左右。

②引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。

③引物碱基： G+C 含量以 40-60% 为宜， G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶 　核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3' 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

⑤引物 3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度 0.1 ～ 1umol 或 10 ～ 100pmol ，以最低引物　量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度 　目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2 。 5U( 指总反应体积为 100ul 时 ) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

　　 dNTP 的质量与浓度　 dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系， dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH 或1MTris 。

HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0 ～ 7.5 ，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。在 PCR 反应中， dNTP 应为 50 ～ 200umol/L ，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 ) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 ( 偏高或偏低 ) ，就会引起错配。

浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。 dNTP 能与 Mg2+ 结合，使游离的 Mg2+ 浓度降低。

　　模板 ( 靶基因 ) 核酸　模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质

结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。 RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA 。

　　 Mg2+ 浓度 　 Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时， Mg2+ 浓度为 1.5 ～ 2.0mmol/L 为宜。 Mg2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。

PCR 反应条件的选择

　　 PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置： 基于 PCR 原理三步骤而设置变性 - 退火 - 延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 90 ～ 95 ℃变性，再迅速冷却至 40 ～60 ℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70 ～ 75 ℃，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因 ( 长度为 100 ～ 300bp 时 ) 可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸 ( 此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性 ) 。

　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下， 93 ℃～94 ℃lmin 足以使模板 DNA 变性，若低于93 ℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失

败。

　　②退火 ( 复性 ) 温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 40 ℃～60 ℃，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度

、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸， G+C 含量约 50% 的引物，55 ℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　 Tm 值 ( 解链温度 )=4(G+C) ＋ 2(A+T)

　　　　　复性温度 =Tm 值 -(5 ～ 10 ℃ )

　　在 Tm 值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 30 ～ 60sec ，足以使引物与模板之间完全结合。

　　③延伸温度与时间： Taq DNA 聚合酶的生物学活性：

　　　　　　　　　 70 ～ 80 ℃ 150 核苷酸 /S/ 酶分子

　　　　　　　　　70 ℃60 核苷酸 /S/ 酶分子

　　　　　　　　　55 ℃24 核苷酸 /S/ 酶分子

　　　　　　　　　高于90 ℃时， DNA 合成几乎不能进行 。

　 　 PCR 反应的延伸温度一般选择在 70 ～ 75 ℃之间，常用温度为72 ℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1min 是足够 的。

3 ～ 4kb 的靶序列需 3 ～ 4min ；扩增 10Kb 需延伸至 15min 。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数　　循环次数决定 PCR 扩增程度。 PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度。一般的循环次数选在 30 ～ 40 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。