怎么确定pcr的退火温度，是参考值减5吗，如果两个引物退火值相差很大怎么办？

可以取中间值试试，但是或许做降落pcr效果会更好，或者梯度pcr摸一下温度。

1.退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8) 只是粗算,有时不灵,但比较简便。

2.用primer5(or oligo6)计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认为这个值就是退火温度,我的经验再加2 or 3度最好。

嗯，退火温度用参考值减五，但只是参考值，用降落PCR的方法以参考值为中心，设置1摄氏度的梯度，然后在合适的范围里再设置一个梯度找到最优退火温度。两引物Tm值相差太大，如果退火温度低就会有引物二聚体，退火温度高，则只有Tm值高的引物与模板结合扩增出单链DNA。两引物的Tm值相差不能大于五摄氏度吧

是，一般是参考值减5，在设计引物的时候，就要控制两个引物的退火温度，不能相差太大。否则还是重新设计引物吧

退火温度低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值来考量，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

退火温度一般是比你设计引物时的tm值低5度。不过这是要摸索的，用温度梯度PCR。（顺便说一下，如果你不想花时间摸索温度，建议就用60度。这个温度是我原来做实验时的万能温度。尤其对较短片段PCR适用）。

另外两个引物的退火温度差别相对比较大,这没有很大关系,只要在退火温度上照顾tm值低的引物序列就可以了。引物在tm值上,可以准确的和互补序列结合,低于tm值同样可以结合,只是特异性差了而已,所以在cDNA扩增目的片段时,选择退火温度比tm值低的较多,可能会扩增出杂带来,这就是因为引物和与其相似性比较高的序列结合,发生了非特异性扩增所致。质粒远没有转录组序列复杂,所以问题不大

就是就低不就高，然后再减5度。