单分子 PCR

单分子 PCR，又称 homo-primer PCR，是一个 DNA 分子为模板，循环数无限的 PCR 技术。

单分子 PCR 的基本原理是单分子 PCR 是从常规的 PCR 衍生而来，其原理与常规 PCR 没有什么区别，不同之处仅在于 其模板的量低至几个甚至一个分子，所以循环数需要比常规的高。因此，为确保试验成功，在模 板的质量、引物设计、DNA 聚合酶的选择、反应条件以及具体操作上与常规 PCR 有较大区别。

单分子 PCR 的常用应用领域如下：

1. 构建蛋白质文库

在高保真度 DNA 聚合酶作用下，SM-PCR 与体外无细胞表达系统结合而成的 SIMPLEX 系 统具有高表达、快速构建蛋白质文库的优点，弥补了常规蛋白质展示技术的一系列缺点，扩大了 蛋白质展示技术的应用范围，特别是应用于毒性蛋白质的表达，改变 DNA 模板数，可获得大小 不同的蛋白质文库。名古屋大学分子生物学研究室已经成功地利用 SIMPLEX 系统构建了抗人类 血清蛋白单链抗体、脂肪酶等蛋白质文库。

2. 体外定向进化

体外定向进化是非理性地改造蛋白质或 DNA 分子的一项技术。目前，这项技术刚刚兴起， 但发展很快。SM-PCR 在低保真 TaqDNA 聚合酶及其它致突变因素的共同作用下，极易导致 DNA 突变, 从而构建出含有大量随机突变的 DNA 文库，当每个循环使用标准错配率为 0.8X 10^-5 个碱基的 Taq 聚合酶时，反应条件偏离的 SM-PCR 可得到 2.5X10^-5 个碱基的错配频率。 因此，在体外定向进化领域中具有广阔的应用前景。

3. 基因组测序

由于 SM-PCR 在高保真 DNA 聚合酶 (如 Pfu DNA 聚合酶) 作用下，能够产生无突变 DNA, 可以广泛应用于各种基因的测序。一段 410bp 的可读序列经过 SM-PCR 后，测序结果显 示 PCR 后的准确率能达到 99.3%。这与 DNA 模板数为 100 的 PCR 结果相似。目前，人类基 因组计划虽已结束，但其草图仅覆盖 85%, 而且还有很多动植物和微生物基因组计划正在实施 中，这些计划极大地促进了 SM-PCR 技术的迅速发展。

4. 法医学鉴定

目前，SM-PCR 在法医学领域的应用越来越广，如性别鉴定、个体识别、亲属鉴定及种属鉴 定等。. 随着智能化犯罪的比例逐年升高、犯罪嫌疑人反侦査意识的增强，在犯罪现场遗留的生物 证据会很少，法医必须从微量或超微量生物检材中 (如眼镜、耳机、牙刷、筷子、汗液、指纹中 提取的皮肤碎屑、口腔上皮细胞等) 获得 DNA 多态信息作为证据，常规 PCR 方法有时不适合此 类鉴定，而 SM-PCR 由于其模板需求量极低，可以充分满足法医学证物鉴定的需要。另外，在 法医学应用领域，目前仍然没有实用有效的方法解决轮奸案件中不同男性个体所遗留精子的分离 鉴定及不同个体混合血细胞分离鉴定的问题，而只能通过比对的方法，降低了个体识别的准确 率。如能将单细胞激光捕获技术与 SM-PCR 技术结合，无疑是解决这类问题的理想手段。SM- PCR 技术在法医学领域有较大的研究潜力及应用价值。

器材：PCR 仪。

试剂：10 X PCR 缓冲液 (0.1 mol/L Tris-Cl pH 8.8, 15 mmol/L MgCl₂, 0. 5mol/L KC1 和 1 % TritonX100), 待测的 DNA 模板，2. 5 mmol/L dNTP, l0pmol 上游引物 LDS, 10pmol 下游引物 LDK, TaqDNA 聚合酶。

单分子 PCR的基本过程可分为如下几步：

1. 反应体系

首先，将纯化的 DNA 用含 lg/L 的蓝色葡聚糖 2000 或 lng/L tRNA 的 TE 溶液稀释到 1 个 (或 5 个、10 个) 分子/μl 的终浓度。接着，按照下述反应体系分别加入各种成分。

2. 反应程序

SM-PCR 是基于常规 PCR 技术原理发展而来的，包括变性、复性、延伸 3 个基本步骤，但 在模板数量、引物设计、DNA 聚合酶选择以及反应条件上与常规 PCR 存在着较大的区别。

1. 模板的准备

SM-PCR 是在 DNA 模板稀释到极端条件下进行的扩增反应，因此模板的质量直接决定了实 验的成败与扩增效率。纯化的 DNA 用含 lg/L 的蓝色葡聚糖 2000 或 lng/L tRNA 的 TE 溶液稀 释到 1 个（或 5 个、10 个）分子/μl 的终浓度。蓝色葡聚糖 2000 或 tRNA 的作用是为了防止 DNA 吸附于管壁上，以保证模板的正常变性、引物的退火以及链的延伸。

2. 引物的设计

SM-PCR 反应混合物中模板的量极低，若引物之间存在少量配对序列，多循环扩增下极易形 成二聚体。因此，在进行引物设计时应严格控制其（G+C）含量和 Tm 值，同时尽量避免引物间 存在可配对的序列。 2000 年，Nakano 等对模板进行了改造，得到末端相同的模板，并使用了 单一引物（single-primer）进行 SM-PCR（又称 homo-primer PCR）。由于该单一引物是人为引入的，可以充分优化，从而有效地避免了引物二聚体的产生，提高了实验成功率。

3.DNA 聚合酶的选择

DNA 聚合酶是 PCR 反应中最重要的一个环节，其保真度以及热稳定性将决定能否扩增出理 想产物。在 SM-PCR 中，模板数很少、循环数多、dNTP 损耗很大。因此在保真度低及热稳定性 差的 DNA 聚合酶作用下，很容易产生突变。因此选择何种 DNA 聚合酶，完全取决于实验是否 需要产生突变。在基因组测序及法医鉴定中为获得大量无突变、高度一致的 PCR 产物，通常选 用高保真度的 PufDNA 聚合酶，其错误掺入率为 7X10-7 个/bp, 在同样实验效率下将 500bp 长 的片段扩增 100 万倍，产物错误率仅为 0.7%。

4.反应条件

SM-PCR 与常规 PCR 在反应条件上主要有以下区别：①SM-PCR 的变性温度（96〜98°C）大多比常规 PCR（94°C）高，其变性时间（5〜15s）短于常规 PCR（40〜60s）, 同时退火时间及 延伸时同也相应缩短；②常规 PCR 循环数多为 35〜40 次，但 SM-PCR 循环数达到 60〜80 次, 总的反应时间多达 3〜5 h, 因此必须选择热稳定性好的 DNA 聚合酶。

5. 预防污染

与其它 PCR 衍生技术相比，污染对于 SM-PCR 影响更大。由于 SM-PCR 中模板数量极少。 少量污染都会导致实验产生错误甚至整个实验失败。在处理样品的过程中，微量移液器、空气等 极易造成样品间的交叉污染。此外，试剂配制中也极易被污染而导致 SM-PCR 污染°因此，在 实验中应注意设阴性对照，同时，注意釆用有效预防措施，如严格的无菌操作、试剂经高温高压 灭菌及分装等。