单分子 PCR

单分子 PCR 的基本原理是单分子 PCR 是从常规的 PCR 衍生而来，其原理与常规 PCR 没有什么区别，不同之处仅在于 其模板的量低至几个甚至一个分子，所以循环数需要比常规的高。因此，为确保试验成功，在模 板的质量、引物设计、DNA 聚合酶的选择、反应条件以及具体操作上与常规 PCR 有较大区别。 

单分子 PCR 的常用应用领域如下：

1. 构建蛋白质文库

在高保真度 DNA 聚合酶作用下，SM-PCR 与体外无细胞表达系统结合而成的 SIMPLEX 系 统具有高表达、快速构建蛋白质文库的优点，弥补了常规蛋白质展示技术的一系列缺点，扩大了 蛋白质展示技术的应用范围，特别是应用于毒性蛋白质的表达，改变 DNA 模板数，可获得大小 不同的蛋白质文库。名古屋大学分子生物学研究室已经成功地利用 SIMPLEX 系统构建了抗人类 血清蛋白单链抗体、脂肪酶等蛋白质文库。

2. 体外定向进化

体外定向进化是非理性地改造蛋白质或 DNA 分子的一项技术。目前，这项技术刚刚兴起， 但发展很快。SM-PCR 在低保真 TaqDNA 聚合酶及其它致突变因素的共同作用下，极易导致 DNA 突变, 从而构建出含有大量随机突变的 DNA 文库，当每个循环使用标准错配率为 0.8X 10^-5 个碱基的 Taq 聚合酶时，反应条件偏离的 SM-PCR 可得到 2.5X10^-5 个碱基的错配频率。 因此，在体外定向进化领域中具有广阔的应用前景。

3. 基因组测序

由于 SM-PCR 在高保真 DNA 聚合酶 (如 Pfu DNA 聚合酶) 作用下，能够产生无突变 DNA, 可以广泛应用于各种基因的测序。一段 410bp 的可读序列经过 SM-PCR 后，测序结果显 示 PCR 后的准确率能达到 99.3%。这与 DNA 模板数为 100 的 PCR 结果相似。目前，人类基 因组计划虽已结束，但其草图仅覆盖 85%, 而且还有很多动植物和微生物基因组计划正在实施 中，这些计划极大地促进了 SM-PCR 技术的迅速发展。

4. 法医学鉴定

目前，SM-PCR 在法医学领域的应用越来越广，如性别鉴定、个体识别、亲属鉴定及种属鉴 定等。. 随着智能化犯罪的比例逐年升高、犯罪嫌疑人反侦査意识的增强，在犯罪现场遗留的生物 证据会很少，法医必须从微量或超微量生物检材中 (如眼镜、耳机、牙刷、筷子、汗液、指纹中 提取的皮肤碎屑、口腔上皮细胞等) 获得 DNA 多态信息作为证据，常规 PCR 方法有时不适合此 类鉴定，而 SM-PCR 由于其模板需求量极低，可以充分满足法医学证物鉴定的需要。另外，在 法医学应用领域，目前仍然没有实用有效的方法解决轮奸案件中不同男性个体所遗留精子的分离 鉴定及不同个体混合血细胞分离鉴定的问题，而只能通过比对的方法，降低了个体识别的准确 率。如能将单细胞激光捕获技术与 SM-PCR 技术结合，无疑是解决这类问题的理想手段。SM- PCR 技术在法医学领域有较大的研究潜力及应用价值。