18T质粒测序结果比对不上

1、测序结果比对时候，选用反向互补；如果依旧不对，2、可能是没连上去，因为PCR能扩出条带，不一定就是你目标条带，PCR不严格，不能完全说明问题。此种情况，建议，挑选多个单克隆，进行PCR，挑选最亮的且条带大小一致的送去测序。

你用18T上带的引物在pcr一下你的菌液试试，可能没有插入，但是菌液中还是带着你的pcr片段的，用你pcr的引物还是可以p出 条带。

检查一下是否存在污染。随机抽一些序列做blast看看是否比对到其他基因组。然后检查全部序列有多少在其他基因组上。如果太多的话就是污染比较严重了。

我自己以前做overlap时也会出现各种各样的问题，要么P不出来，要么连的片段不对，后来我改用无缝克隆试剂盒来做

没对比上，是空载体还是有一些基因不对，有可能挑到的单克隆是杂合子

可能是假阳性，在平板涂布时目的基因遗留了一部分在平板上，菌液pcr就是阳性

可能是菌落PCR的假阳性，很可能是因为你做PCR的循环数过大，循环数不会超过25个，一般用25个。假阳性出现的原因关键在于做连接的时候加了比较多的目的基因的酶切产物，在转化时，那些没有连接入载体的PCR产物，有的会沾在感受态细胞上，还有的虽然在溶液中，涂板时一起就一起涂在板上了，挑菌的时候可能会挑到，即使没挑到，但菌表面的基因片段也有可能被扩增，如果你的循环数太高，就会在PCR时呈现阳性结果。