蛋白质实验

层析（chromatography）也称色谱，是利用蛋白质在流动相和固定相中分配不同的原理进行蛋白质分离纯化的方法。由于蛋白质理化特性的不同（分子形状、大小、极性及亲和力等），当蛋白质溶液流经固定相时，不同的蛋白质就会以不同强度的作用力结合在固定相上，实现蛋白质的分离。目前，用于蛋白质的层析纯化的方法主要有 4 种：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和疏水作用层析。

蛋白质为两性电解质，在高于或低于等电点的溶液中会表现出带电的特性。在直流电场力的作用下，这些带电的蛋白质会发生泳动迁移。利用蛋白质在电场中的泳动速度来分离蛋白质的技术称为电泳（electrophoresis）。目前，用于蛋白质的电泳分离的方法主要有 3 种：聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳和双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。

活性氧自由基是机体氧化反应过程中产生的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞。自由基通过氧化作用攻击生物大分子物质，导致 DNA、蛋白质、脂膜等结构损伤，与退行性疾病、心血管疾病、肿瘤发生等密切相关。细胞内源性的自由基清除系统，如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶等，有助于清除体内的自由基，降低自由基对细胞的危害。目前活性氧自由基和清除体系活性分析的实验方法有 2 种：活性氧

氨基酸在体内一方面主要用以合成机体自身所特有的蛋白质、多肽及其他含氮物质；另一方面可通过脱氨作用、转氨作用、联合脱氨或脱羧作用，分解成α－酮酸、胺类及二氧化碳。氨基酸分解所生成的α－酮酸可以转变成糖、脂类或再合成某些非必需氨基酸，也可以经过柠檬酸循环氧化成二氧化碳和水，并释放能量。目前用于氨基酸代谢产物分析的方法主要有 4 种：谷氨酰胺酶活性分析、丙氨酸转氨酶活性分析、谷氨酰胺含量测定和谷氨酸含量

脂肪代谢是机体能量供应的重要来源，脂质的合成与分解失衡则引发脂质代谢紊乱。脂肪酸合成增多，氧化分解降低，会导致细胞内脂质积累。脂肪细胞的积累是肥胖病的基础，也是糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤和心血管疾病等多种疾病发生的重要危险因素。目前用于脂肪代谢产物分析的方法主要有 2 种：脂肪酸合成酶活性测定和脂质含量检测。

磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）是葡萄糖氧化分解的一种方式，可以产生 NADPH，并合成磷酸核糖，为核酸代谢提原料。葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PDH）是磷酸戊糖途径的关键酶，催化葡萄糖－6－磷酸氧化为葡萄糖－6－磷酸内酯，同时将 NADP＊还原为 NADPH，用于生物合成，并维持细胞内的还原状态。因此，G6PDH 的活性高低在一定程度上反映出生物体的生物合成和抗

在有氧条件下，葡萄糖氧化分解生成二氧化碳和水的过程称为有氧氧化（aerobic oxidation），是生物机体获取能量的主要方式。该过程分为 3 个阶段：第一阶段为糖酵解途径，葡萄糖转变成 2 分子丙酮酸，在细胞质中进行；第二阶段丙酮酸进入线粒体，经丙酮酸脱氢酶复合体催化，脱羧基转化成乙酰 CoA；第三阶段为柠檬酸循环和氧化磷酸化过程。柠檬酸循环的起始物乙酰 CoA，不仅是葡萄糖的氧化分解产物，

葡萄糖经历糖酵解（glycolysis）的 10 步代谢反应，生成酮酸，然后进一步生成乳酸，或者进入线粒体脱羧成为乙酰辅酶 A（CoA），进入柠檬酸循环。在葡萄糖无氧氧化生成乳酸的代谢途径中，有 4 个关键酶决定着反应速度和方向，即己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶－1（phosphofructokinase－1，PFK－1）、 丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）

蛋白质的糖基化 （glycosylation） 是目前已知最为复杂的蛋白质翻译后修饰，由 8 种单糖参与构成的各种复杂寡糖链与蛋白质连接形成。蛋白质糖基化分析包括：蛋白质是否发生了糖基化及糖基连接形式 、糖基化位点分析和糖链结构分析。蛋白质糖基化分析的方法主要有两种：内切糖苷酶分析 N－ 连接寡糖和糖基化抑制剂用千鉴定糖蛋白。

蛋白质分子能够结晶的现象在 170 多年以前就已被报道。1895 年 R？ntgen WC 发现 X－射线和 1912 年 Laue MV 发现晶体的 X－射线衍射（X－raydiffraction）现象，开创了晶体结构研究的新纪元。1953 年，Perutz MF 用重原子同晶置换法解决了生物大分子晶体结构测定中衍射的相位问题。1957 年和 1959 年，Kendrew JC 和 Perutz

泛素（ubiquitin，Ub）是由 76 个氨基酸组成的 8.6 kDa 的蛋白质分子，在细胞中广泛存在。 它的 C－ 末端的甘氨酸残基提供了 一个与其他蛋白质分子连接的游离羧基，可共价结合在其他蛋白质分子的赖氨酸侧链氨基上，称为泛素化（ubiquitination）。此外，泛素中含有 7 个赖氨酸残基， 其中 Lys－48、Ly－63、Lys - 29 均能通过与另一分子 Ub 的 C－末端连

蛋白质的可逆磷酸化是细胞多种功能调节的基础，在蛋白激酶 （protein kinase） 和蛋白磷酸酶的双重控制下进行。原核生物的蛋白质磷酸化 （protein phosphorylation） 主要参与细菌的趋化性调控，发生磷酸化的残基是组氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。在真核生物，磷酸化则主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体 ATP 的

蛋白质-蛋白质相互作用在诸如生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用，因此对这种作用的研究对于了解生命活动规律具有深远意义。GST pull-down 分析主要用于蛋白质-蛋白质相互作用研究。

蛋白质的等电点是蛋白质的重要特性之一。测定蛋白质的等电点对于了解目的蛋白质的理化性质和设计纯化目的蛋白的策略均有重要帮助。目前，用于测定蛋白质的等电点的方法主要有一种：等电聚焦电泳测定蛋白质等电点。

蛋白质的半衰期即蛋白质降解一半所需的时间，是用以衡量蛋白质稳定性的基本指标，蛋白质半衰期越长表明蛋白质在细胞内越稳定。目前，用于测定蛋白质半衰期的方法主要有两种：脉冲追踪标记法和放线菌酮阻断法。

蛋白质的精确分子量是指分子中含有的全部原子量的总和。目前，用于测定蛋白质精确分子量的方法主要有一种：质谱法测定蛋白质精确分子量。

基于蛋白质光吸收特性测定蛋白质总含量是基于蛋白质不同化学键光吸收特性。目前，基于蛋白质光吸收特性测定蛋白质总含量的方法主要有一种：如紫外光谱吸收法。

基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量是在蛋白质的各种化学呈色反应基础上建立的各种比色法（colori-metry）。目前，基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量的方法主要有三种：如 Lowry 法、二喹啉甲酸法和考马斯亮蓝法。

基于蛋白质元素组成测定蛋白质总含量是基于蛋白质的元素组成特点直接进行分析的方法。目前，基于蛋白质元素组成测定蛋白质总含量的方法主要有一种：如凯氏定氮法。

细胞可溶性蛋白质是指一些能够溶于水或水溶液的细胞内蛋白质分子。目前，用于细胞可溶性蛋白质的含量测定的方法主要有三种：蛋白质的电泳染色分析、蛋白质的免疫印迹法分析和蛋白质分子的流式细胞术分析。