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有氧氧化过程关键酶和重要产物测定

实验分类:

蛋白质实验

最新修订时间:

简介

在有氧条件下,葡萄糖氧化分解生成二氧化碳和水的过程称为有氧氧化(aerobic oxidation),是生物机体获取能量的主要方式。该过程分为 3 个阶段:第一阶段为糖酵解途径,葡萄糖转变成 2 分子丙酮酸,在细胞质中进行;第二阶段丙酮酸进入线粒体,经丙酮酸脱氢酶复合体催化,脱羧基转化成乙酰 CoA;第三阶段为柠檬酸循环和氧化磷酸化过程。柠檬酸循环的起始物乙酰 CoA,不仅是葡萄糖的氧化分解产物,也可来自于甘油、脂肪酸和某些氨基酸代谢。因此,柠檬酸循环是糖、脂肪和蛋白质 3 种主要有机物在体内彻底氧化的共同代谢途径。其中,丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶是柠檬酸循环过程的限速酶。

用于有氧氧化过程关键酶和重要产物测定的基本方法有 7 种:丙酮酸脱氢酶活性检测、柠檬酸合酶活性检测、异柠檬酸脱氢酶活性检测、α-酮戊二酸脱氢酶活性测定、乙酰 CoA 含量分析、异柠檬酸含量分析和α-KG 含量分析。

原理

根据实验方法不同,对应的原理也有所不同:

方法一:丙酮酸脱氢酶活性检测的基本原理是:丙酮酸脱氢酶系是一多酶复合体,定位于线粒体,由丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase,PDH)、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶、丙酮酸脱氢酶磷酸酶、功能未知的蛋白 X 和一些辅助因子等共同构成。其中以丙酮酸脱氢酶的功能最为重要,催化丙酮酸脱羧成乙酰 CoA。丙酮酸脱氢酶的活性可以评价细胞柠檬酸循环代谢的速率。检测原理是:利用 PDH 抗体将 PDH 酶复合物吸附并固定于检测孔,然后加入反应底物 CoA。PDH 催化 CoA 生成乙酰 CoA,释放出 CO2,并使 NAD*转换为 NADH。NADH 可进一步催化反应标记物呈现颜色反应(黄色),在 450 nm 检测吸光度值可计算 PDH 的酶活性。

方法二:柠檬酸合酶活性检测的基本原理是:柠檬酸合酶(citroyl synthetase)在柠檬酸循环第一步反应中催化乙酰 CoA 与草酰乙酸结合,生成柠檬酸和带有硫醇基的 CoA(CoA-SH)。其中,乙酰 CoA 和草酰乙酸是柠檬酸合酶的激活剂,而 NADH、琥珀酰 CoA 是其抑制剂。在反应过程中生成的 CoA 可与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反应生成有呈色反应的二硝基苯甲酸(TNB)。通过检测 412nm 的吸光度值,可分析柠檬酸合酶的活性。

方法三:异柠檬酸脱氢酶活性检测的基本原理是:异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,IDH)催化异柠檬酸(isocitrate)氧化 脱氢生成中间产物草酰琥珀酸(oxalosuccinate),然后进一步氧化脱羧生成α-酮戊二酸(ox-ketoglutarate,α-KG),同时生成 NADPH。该酶大量存在于肝、骨骼肌和肾等组织中,其活性高低反映出细胞的生物合成和抗氧化能力。细胞中存在着两种类型的 IDH,其中线粒体中的 IDH 以 NAD*为辅酶,而胞质中的 IDH 则主要以 NADP*为辅酶。其测定原理是加入氧化性 NADP*或 NAD'反应底物,IDH 酶可催化其生成还原性 NADPH 或 NADH,并在 340nm 处有最大吸光度。通过测定 NADH 或 NADPH 的浓度,计算 IDH 酶活性。

方法四:α-酮戊二酸脱氢酶活性测定的基本原理是:α-酮戊二酸脱氢酶 α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-KGDH)复合体由 3 个酶(α-KGDH、琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶)组成。其中的α-KGDH 催化α-KG 氧化脱羧生成琥珀酰 CoA 和 NADH,NADH 在 340nm 有特征吸收峰,以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 的酶活性。

方法五:乙酰 CoA 含量分析的基本原理是:乙酰 CoA 含量分析乙酰 CoA 是糖、脂肪、蛋白质三大营养物质代谢的汇集点。测定原理是首先将游离的 CoA 淬灭,然后将样品内乙酰 CoA 转化成 CoA。转化生成的 CoA 将被加成到 NADH 分子上,后者与 PicoProbe 等荧光探针结合,产生荧光。根据荧光值,计算乙酰 CoA 的含量。

方法六:乙酰 CoA 含量分析的基本原理是:异柠檬酸是柠檬酸循环中柠檬酸和α-KG 的中间产物,在异柠檬酸脱氢酶催化下氧化形成α-KG 和 NADPH。在 340 nm 下测定 NADPH 浓度的变化,可以计算出异柠檬酸的含量。

方法七:α-KG 含量分析的基本原理是:α-KG 是柠檬酸循环中的一个关键中间代谢物,异柠檬酸经过α-KG 向琥珀酰 CoA 转化,谷氨酸的转氨基作用也可以产生α-KG。α-KG 经加氨反应,可被催化生成丙酮酸。后者能够与近无色的探针反应,使之显色,并激发出荧光。检测吸光度值和荧光可计算α-KG 的含量。样品内源性的酶类会干扰检测结果,检测前需利用过氯酸或氢氧化钾去除蛋白质成分。

来源:丁香实验团队

操作方法

丙酮酸脱氢酶活性检测

丙酮酸脱氢酶系是一多酶复合体,定位于线粒体,由丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase,PDH)、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶、丙酮酸脱氢酶磷酸酶、功能未知的蛋白 X 和一些辅助因子等共同构成。其中以丙酮酸脱氢酶的功能最为重要,催化丙酮酸脱羧成乙酰 CoA。丙酮酸脱氢酶的活性可以评价细胞柠檬酸循环代谢的速率。

柠檬酸合酶活性检测

柠檬酸合酶(citroyl synthetase)在柠檬酸循环第一步反应中催化乙酰 CoA 与草酰乙酸结合,生成柠檬酸和带有硫醇基的 CoA(CoA-SH)。其中,乙酰 CoA 和草酰乙酸是柠檬酸合酶的激活剂,而 NADH、琥珀酰 CoA 是其抑制剂。

异柠檬酸脱氢酶活性检测

异柠檬酸脱氢酶(isocitratedehydrogenase,IDH)催化异柠檬酸(isocitrate)氧化 脱氢生成中间产物草酰琥珀酸(oxalosuccinate),然后进一步氧化脱羧生成α-酮戊二酸(ox-ketoglutarate,α-KG),同时生成 NADPH。该酶大量存在于肝、骨骼肌和肾等组织中,其活性高低反映出细胞的生物合成和抗氧化能力。细胞中存在着两种类型的 IDH,其中线粒

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