有氧氧化过程关键酶和重要产物测定

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

在有氧条件下，葡萄糖氧化分解生成二氧化碳和水的过程称为有氧氧化（aerobic oxidation），是生物机体获取能量的主要方式。该过程分为 3 个阶段：第一阶段为糖酵解途径，葡萄糖转变成 2 分子丙酮酸，在细胞质中进行；第二阶段丙酮酸进入线粒体，经丙酮酸脱氢酶复合体催化，脱羧基转化成乙酰 CoA；第三阶段为柠檬酸循环和氧化磷酸化过程。柠檬酸循环的起始物乙酰 CoA，不仅是葡萄糖的氧化分解产物，也可来自于甘油、脂肪酸和某些氨基酸代谢。因此，柠檬酸循环是糖、脂肪和蛋白质 3 种主要有机物在体内彻底氧化的共同代谢途径。其中，丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α－酮戊二酸脱氢酶是柠檬酸循环过程的限速酶。

用于有氧氧化过程关键酶和重要产物测定的基本方法有 7 种：丙酮酸脱氢酶活性检测、柠檬酸合酶活性检测、异柠檬酸脱氢酶活性检测、α－酮戊二酸脱氢酶活性测定、乙酰 CoA 含量分析、异柠檬酸含量分析和α－KG 含量分析。

原理

根据实验方法不同，对应的原理也有所不同：

方法一：丙酮酸脱氢酶活性检测的基本原理是：丙酮酸脱氢酶系是一多酶复合体，定位于线粒体，由丙酮酸脱氢酶（pyruvatedehydrogenase，PDH）、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶、丙酮酸脱氢酶磷酸酶、功能未知的蛋白 X 和一些辅助因子等共同构成。其中以丙酮酸脱氢酶的功能最为重要，催化丙酮酸脱羧成乙酰 CoA。丙酮酸脱氢酶的活性可以评价细胞柠檬酸循环代谢的速率。检测原理是：利用 PDH 抗体将 PDH 酶复合物吸附并固定于检测孔，然后加入反应底物 CoA。PDH 催化 CoA 生成乙酰 CoA，释放出 CO2，并使 NAD＊转换为 NADH。NADH 可进一步催化反应标记物呈现颜色反应（黄色），在 450 nm 检测吸光度值可计算 PDH 的酶活性。

方法二：柠檬酸合酶活性检测的基本原理是：柠檬酸合酶（citroyl synthetase）在柠檬酸循环第一步反应中催化乙酰 CoA 与草酰乙酸结合，生成柠檬酸和带有硫醇基的 CoA（CoA－SH）。其中，乙酰 CoA 和草酰乙酸是柠檬酸合酶的激活剂，而 NADH、琥珀酰 CoA 是其抑制剂。在反应过程中生成的 CoA 可与二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反应生成有呈色反应的二硝基苯甲酸（TNB）。通过检测 412nm 的吸光度值，可分析柠檬酸合酶的活性。

方法三：异柠檬酸脱氢酶活性检测的基本原理是：异柠檬酸脱氢酶（isocitratedehydrogenase，IDH）催化异柠檬酸（isocitrate）氧化脱氢生成中间产物草酰琥珀酸（oxalosuccinate），然后进一步氧化脱羧生成α－酮戊二酸（ox－ketoglutarate，α－KG），同时生成 NADPH。该酶大量存在于肝、骨骼肌和肾等组织中，其活性高低反映出细胞的生物合成和抗氧化能力。细胞中存在着两种类型的 IDH，其中线粒体中的 IDH 以 NAD＊为辅酶，而胞质中的 IDH 则主要以 NADP＊为辅酶。其测定原理是加入氧化性 NADP＊或 NAD＇反应底物，IDH 酶可催化其生成还原性 NADPH 或 NADH，并在 340nm 处有最大吸光度。通过测定 NADH 或 NADPH 的浓度，计算 IDH 酶活性。

方法四：α－酮戊二酸脱氢酶活性测定的基本原理是：α－酮戊二酸脱氢酶 α－酮戊二酸脱氢酶（α－ketoglutarate dehydrogenase，α－KGDH）复合体由 3 个酶（α－KGDH、琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶）组成。其中的α－KGDH 催化α－KG 氧化脱羧生成琥珀酰 CoA 和 NADH，NADH 在 340nm 有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示α－KGDH 的酶活性。

方法五：乙酰 CoA 含量分析的基本原理是：乙酰 CoA 含量分析乙酰 CoA 是糖、脂肪、蛋白质三大营养物质代谢的汇集点。测定原理是首先将游离的 CoA 淬灭，然后将样品内乙酰 CoA 转化成 CoA。转化生成的 CoA 将被加成到 NADH 分子上，后者与 PicoProbe 等荧光探针结合，产生荧光。根据荧光值，计算乙酰 CoA 的含量。

方法六：乙酰 CoA 含量分析的基本原理是：异柠檬酸是柠檬酸循环中柠檬酸和α－KG 的中间产物，在异柠檬酸脱氢酶催化下氧化形成α－KG 和 NADPH。在 340 nm 下测定 NADPH 浓度的变化，可以计算出异柠檬酸的含量。

方法七：α－KG 含量分析的基本原理是：α－KG 是柠檬酸循环中的一个关键中间代谢物，异柠檬酸经过α－KG 向琥珀酰 CoA 转化，谷氨酸的转氨基作用也可以产生α－KG。α－KG 经加氨反应，可被催化生成丙酮酸。后者能够与近无色的探针反应，使之显色，并激发出荧光。检测吸光度值和荧光可计算α－KG 的含量。样品内源性的酶类会干扰检测结果，检测前需利用过氯酸或氢氧化钾去除蛋白质成分。

来源：丁香实验团队

操作方法

丙酮酸脱氢酶活性检测

丙酮酸脱氢酶系是一多酶复合体，定位于线粒体，由丙酮酸脱氢酶（pyruvatedehydrogenase，PDH）、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶、丙酮酸脱氢酶磷酸酶、功能未知的蛋白 X 和一些辅助因子等共同构成。其中以丙酮酸脱氢酶的功能最为重要，催化丙酮酸脱羧成乙酰 CoA。丙酮酸脱氢酶的活性可以评价细胞柠檬酸循环代谢的速率。

柠檬酸合酶活性检测

柠檬酸合酶（citroyl synthetase）在柠檬酸循环第一步反应中催化乙酰 CoA 与草酰乙酸结合，生成柠檬酸和带有硫醇基的 CoA（CoA－SH）。其中，乙酰 CoA 和草酰乙酸是柠檬酸合酶的激活剂，而 NADH、琥珀酰 CoA 是其抑制剂。

异柠檬酸脱氢酶活性检测

异柠檬酸脱氢酶（isocitratedehydrogenase，IDH）催化异柠檬酸（isocitrate）氧化脱氢生成中间产物草酰琥珀酸（oxalosuccinate），然后进一步氧化脱羧生成α－酮戊二酸（ox－ketoglutarate，α－KG），同时生成 NADPH。该酶大量存在于肝、骨骼肌和肾等组织中，其活性高低反映出细胞的生物合成和抗氧化能力。细胞中存在着两种类型的 IDH，其中线粒