基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量

蛋白质实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量是在蛋白质的各种化学呈色反应基础上建立的各种比色法（colori-metry）。目前，基于蛋白质化学呈色反应测定蛋白质总含量的方法主要有三种：如 Lowry 法、二喹啉甲酸法和考马斯亮蓝法。

原理

Lowry 法测定蛋白质总含量的基本原理涉及两步反应，第一步反应是基于原双缩脲测定法，即在碱性溶液中蛋白质中的肽键与 Cu²⁺反应形成紫色的络合物（两个以上肽键接近存在的情况下，在强碱性一侧与 Cu²⁺形成络合盐），其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比；第二步反应是基于酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）被蛋白质中的芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸）残基还原，反应呈现深蓝色。

二喹啉甲酸法测定蛋白质总含量的基本原理是在碱性溶液中，蛋白质中的肽键能与 Cu²⁺反应生成 Cu⁺，BCA 试剂能与 Cu⁺反应形成稳定的紫色复合物，并在 562 nm有很强的吸收峰。

考马斯亮蓝法测定蛋白质总含量的基本原理是考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue）G-250 在一定浓度的乙醇和酸性溶液中呈红色。在此溶液条件下，考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合，并导致考马斯亮蓝G-250的颜色从红色变为蓝色，最大光吸收峰从 465nm 移至 595nm。考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质的复合物在 595nm 波长处具有很高的光吸收系数，并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。

来源：蛋白质的定性定量分析技术-《医学分子生物学实验技术》药立波第四版

操作方法

比色法（Lowry法）测定蛋白质总含量

Lowry 法是 O．Lowry 于 1951 年在 Folin 酚试剂法和双缩脲法的基础上建立的蛋白质含量分析法，因此也称为 Lowry 改良法。这一方法在 20 世纪 50 年代到 90 年代中期一直作为蛋白质含量分析的主要方法。原理比色法（Lowry法）测定蛋白质总含量的基本原理涉及两步反应，第一步反应是基于原双缩脲测定法，即在碱性溶液中蛋白质中的肽键与 Cu2+ 反应形成紫色的络合物（

比色法（二喹啉甲酸法）测定蛋白质总含量

二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA 法）是一种类似 Lowry 法的蛋白定量方法，该方法只需一步反应且不易受其他物质干扰。原理比色法（二喹啉甲酸法）测定蛋白质总含量的基本原理是在碱性溶液中，蛋白质中的肽键能与 Cu2+ 反应生成 Cu+ ，BCA试剂能与 Cu+ 反应形成稳定的紫色复合物，并在 562nm 有很强的吸收峰。

比色法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质总含量

考马斯亮蓝法操作简单快速，近年来在某些方面有取代经典 Lowry 法的趋势。原理比色法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质总含量的基本原理是考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue）G-250 在一定浓度的乙醇和酸性溶液中呈红色。在此溶液条件下，考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合，并导致考马斯亮蓝 G-250 的颜色从红色变为蓝色，最大光吸收峰从 465nm 移至 595nm 。考马