简介
原理
用途
材料与仪器
步骤
实验流程10-2 Lowry法测定含有非离子去垢剂样品的蛋白含量(微量法) | ||||||||
A.准确称量标准品蛋白,用与样品相同的细胞裂解缓冲液溶解,使其浓度为5mg/ml。以此浓度开始,用细胞裂解缓冲液将标准品蛋白稀释为下表中的各个蛋白质浓度,每个浓度50μl为宜。 | ||||||||
B.适当稀释样品(凭经验或做数个不同稀释浓度)。 | ||||||||
C.准备 SolutionA':根据样品数量取出适量Solution A,按照每毫升 Solution A 加入 30μl Solution S的比例混合即成Solution A'。 | ||||||||
D.按下表在微量离心管内分别加入各试剂(单位为μl): | ||||||||
管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
标准蛋白质溶液 | - | 15.0 | 15.0 | 15.0 | 15.0 | 15.0 | 15.0 | - |
(蛋白质浓度mg/ml) | 0.0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 待测 |
待测样品 | - | - | - | - | - | - | - | 15.0 |
样品缓冲液 | 15.0 | - | - | - | - | - | - | - |
Solution A' | 75.0 | 75.0 | 75.0 | 75.0 | 75.0 | 75.0 | 75.0 | 75.0 |
Solution B | 600.0 | 600.0 | 600.0 | 600.0 | 600.0 | 600.0 | 600.0 | 600.0 |
E.室温放置15min。 | ||||||||
F.用分光光度计在750nm波长处以1号管调零点,再测定各管吸光度(A)。 | ||||||||
G.以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,用手工或用计算机绘制标准曲线,根据标准曲线计算 | ||||||||
出待测样品中的蛋白含量(如样品经过稀释,应注意计算稀释前的蛋白含量)。 |
注意事项
1. 所用标准品溶液的蛋白浓度范围应该与其呈色强度有良好的线性关系,浓度过低或过高都会超出线性区域,不能准确反映蛋白质的含量。常用标准品有牛血清白蛋白,应购买高纯度的产品作为标准品。
2.在每次测定样品的同时必须用蛋白标准品作标准曲线,不能用以往实验中的标准曲线读数替代,因为试剂和反应环境在每一次实验中都会有所不同。
3.待测样品应呈完全溶解状态,浓度亦应仔细调整,使其测定值在标准曲线范围内,否则会产生相当大的误差。
4.应用 Lowry 法测定溶液中蛋白含量时应该特别注意是否存在干扰物质。一方面要避免使用干扰测定的试剂,另一方面要充分估计待测样品中的干扰物质对测定值的影响。为了准确测定样品,实验中应该采用与样品溶剂完全相同的溶剂进行标准品的溶解和稀释。
来源:丁香实验