比色法（二喹啉甲酸法）测定蛋白质总含量

二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA 法） 是一种类似 Lowry 法的蛋白定量方法，该方法只需一步反应且不易受其他物质干扰。

原理

A．准备蛋白标准品 取适量的标准 BSA 溶液（2mg／ml），加入等体积 0.2mol／L NaOH 并混匀，按表 Ⅲ-1 制备不同浓度的蛋白标准品，每个浓度准备 2 管。

B．准备待测蛋白质样品 如为液体样品，样品用 H2O 做不同浓度的稀释（或不稀释）。加入与稀释后样品等体积的 0.2mol／L NaOH，使样品的显色保持在可测量的范围内。如为固体样品，样品以 2mol／L NaOH 溶解，将溶解后的样品用水10倍稀释，再按可检测到的适宜浓度用去离子水稀释样品，使样品的显色保持在可测量的范围内，NaOH 的终浓度为 0.1mol／L。

（1）取 50 倍体积的 A 液，加入 1 倍体积的 B 液，迅速混匀。按照需要的总量配制工作液，配好的工作液于室温放置，1 天内可以使用。

（2）在已准备好的标准品和待测样品中各加入 1.0ml 工作液，立即混匀。

（3）37℃ 恒温水浴 30 分钟（测量范围：20～2000μg／ml），或室温 2 小时（测量范围：20～2000μg／ml），或 60℃ 水浴 30 分钟（测量范围：5～250μg／ml）。

（4）将保温后的所有试管冷却到室温。室温下读取各管在 562nm 波长处的吸光度（As62）。

（5）将标准品管和待测样品管的读数减去空白管读数，得到校正后各管的 As62 值。

（6）以各标准管蛋白含量为横坐标，各标准管的 As62 值为纵坐标，绘制标准曲线。

1．过浓的待测样品需要进行稀释 稀释有以下作用：

①降低干扰物的浓度，如必须使巯基乙醇的浓度＜0.01％、DTT＜1mmol／L、SDS＜5％、脱氧胆酸＜5％、甘氨酸＜lmmol／L、尿素＜3mol／L、EDTA＜10mmol／L、NaCl＜1mol／L；

②使样品完全溶解；

③使呈色反应在碱性环境中进行；

④使呈色后样品的吸光度落在标准曲线的中段，此处测量最可靠；

⑤为了稀释准确，稀释容量不能太小。如做 2 倍稀释，不能取 1μl 样品加 1μl 稀释液，可取 100μl 样品加 100μl 稀释液。每份待测样品至少要做 2 个不同的稀释度。

2．温度 样品加入工作液保温后，必须冷却到室温。最好在 10 分钟内完成所有样品的读数。尽管室温下 BCA 呈色反应还在缓慢发生，但每 10 分钟光吸收值仅增加 2.3％，因此各样品的读数误差不会太大。