蛋白质的定量测定方法：二喹啉甲酸法(BCA法)

【实验目的】

掌握用BCA方法测定蛋白质含量的原理和操作方法

【实验原理】

BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单， 试剂 更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。

蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu 2+ 络合生成络合物，同时将Cu 2+ 还原成Cu + 。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu + 结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

【 实验材料 】

1. 实验器材

721分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管架和试管。

2 . 实验 试剂

(1) BCA试剂的配制

① 试剂A，1L：分别称取10g BCA (1%)，20g Na 2 CO 3 ·H 2 O (2%)，1.6g Na 2 C 4 H 4 O 6 ·2H 2 O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO 3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO 3 调节pH值至11.25。

② 试剂B，50ml：取2g CuSO 4 ·5H 2 O (4%)，加蒸馏水至50ml。

③ BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。

(2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

(3)样品溶液：配制约50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作为样品。

【实验操作】

1. 绘制标准曲线

管号	1	2	3	4	5	6
标准蛋白溶液（μl） 蒸馏水（μl） BCA试剂（ml） 蛋白质含量（μg）	0 250 5 0	50 200 5 20	100 150 5 40	150 100 5 60	200 50 5 80	250 0 5 100

上述试剂加完后，混匀，于37℃保温30min，冷却至室温后，以第1管为对照，在562nm处比色，读取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定

准确吸取250μl样品溶液于一干燥洁净的 试管 中，加入BCA试剂5ml，摇匀，于37℃保温30min，冷却至室温后， 以标准曲线1号管为对照，在595nm处比色，记录吸光值。

【实验结果】