蛋白质的定量测定方法

【 实验目的 】

1.学习Folin-酚 试剂 法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握Folin-酚 试剂 法测定蛋白质含量的方法和操作。

【 实验原理 】
蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu ²⁺ 作用生成蛋白质-Cu ²⁺ 复合物；第二步：蛋白质-Cu ²⁺ 复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。
Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。

【 实验材料 】
1.实验器材
100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度计。
2.实验试剂
(1) Fo1in-酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50ml 0.lmol／L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜(CuSO ₄ ·5H ₂ O)溶于100m1 1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50ml与后者lml混合。混合后1日内使用有效。
(2)Folin-酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na ₂ WO _⁴ ·2H ₂ O)、25g钼酸钠(Na ₂ MoO ₄ ·2H ₂ O)、700ml蒸馏水、50ml 85％磷酸及100ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置于棕色瓶中暗处保存。使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释(约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。
(3)标准蛋白质溶液：用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸馏水完全溶解后，转移至100毫升容量瓶中，准确稀释至刻度，使蛋白质浓度1mg/ml。
(4)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。

【 实验操作 】
1. 绘制标准曲线
取7支 试管 ，按下表分别加入各试剂

摇匀，室温下放置10分钟

Fo1in-酚试剂乙(ml)

1

1

1

1

1

1

1

各管加入Fo1in-酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在500nm处记下各管光密度，以0号管为对照，以光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 测定未知样品：取2支 试管 ，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加5毫升Fo1in-酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in-酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值。

【 实验结果 】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。