实验56 蛋白质含量的测定

实验56 蛋白质含量的测定

　　在研究植物的营养、代谢作用以及生长发育等生命活动时，往往需要测定样品中的蛋白质含量，测定蛋白质的方法有许多，不同的测定方法，乃根据蛋白质的不同理化特性，而不同的蛋白质由于结构不同、组成分不同，它们的理化特性也就很不相同，对不同的测定方法反应也就很难一致，因此，可以说没有一种测定方法在各种条件下都能适用。所以当你选用某一测定方法时，应该注意到：

　　(1)该方法所依据的原理是什么？(2)检测的灵敏度如何？(3)对不同蛋白质的反应有无差异？(4)有哪些因素会干拢测定？

　　下面列举几种在文献上常用的测定方法。

Ⅰ．微量克氏定氮法

原理

　　蛋白质是含氮有机物，自然界中的蛋白质含氮比较稳定，平均含量约为165，即100g蛋白质平均含氮16g。因此在测定生物样品的蛋白质含量时，可先测定样品中的含氮量，再乘以系数6.25，便可换算成蛋白质含量。克氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法。

　　样品用浓硫酸消化时，其中的含氮有机物分解放出氨，氨与硫酸化合生成硫酸铵。在消化时常加入硫酸铜和硫酸钾作催化剂，以加速分解速度并提高消化的温度。消化完华，加入强碱使消化液中的硫酰铵分解，放出氨。利用蒸汽蒸馏法，用硼酸溶液吸收蒸馏出来的氨，氨与硼酸溶液中的氢离子结合生成离子，使吸收液中的氨离子浓度下降，然后用标准酸溶液滴定，使吸收液中的氢离子恢复到原先的浓度，即可从消耗的酸量，计算样品中的含氮量。

　　消化，蒸馏的化学反应可归纳如下：

(NH₄ )₂ SO₄ 2NaOH→2NH3↑ Na₂ SO₄ 2H₂ O

仪器药品

　　克氏蒸馏器　　　　 克氏烧瓶

　　消化架　　　　　　 三角烧瓶

　　滴定管　　　　　　 移液管

　　量筒 　　　　　　　烧杯

　　天平 　　　　　　　2%硼酸

　　浓硫酸

　　催化剂：硫酸铜和硫酸钾按3∶1混合，研细。

　　混合指示剂：0.1%溴甲酚绿酒精溶液10ml，0.1%甲基红酒精溶液2ml，混合即得，贮于棕色瓶内。

操作步骤

　　1．样品的消化

　　(1)在分析天平上准确称取植物样品干粉（40─60目过筛）100─500mg（视样品中含氮量而定）2份。

　　(2)取50ml克氏烧瓶3只，将称好的样品分别送入第1、2只烧瓶底部，第3只烧瓶不加样品，作为空白对照，以测定试剂中的微量含氮化合物。于各个烧瓶中加入催化剂0.3g，浓硫酸5ml，然后将烧瓶置于通风橱消化架上，先用小火加热，待瓶内水分蒸完，硫酸开始放出SO₂ 白烟，可加大火焰，使液体保持微沸状，直至溶液呈透明蓝绿色为止。在消化过程中，要经常转动烧瓶，使得瓶壁上的碳化颗粒，为浓硫酸回流至瓶底，使消化完全。为了缩短消化时间，当溶液变为浅棕色时，可加3─4滴30%过氧化氢。

　　消化完毕，冷却，待蒸馏。

　　2．氨的蒸馏

　　(1)蒸馏装置的洗涤：先用自来水将克氏定氮仪清洗干净，按图19装置好。在蒸汽发生瓶中（烧瓶1）加入约2/3体积的蒸馏水，加入浓硫酸数滴（在酸性情况下，水中氨不会蒸馏出来）及沸石（或毛细管数根）使沸腾均匀，关闭活塞A和B，将烧瓶1中的水煮沸，使蒸汽充分洗涤仪器，并检查装置的各个部分有无漏气现象，然后打开活塞B，让蒸汽洗涤漏斗约5分钟，再将活塞B关闭，继续蒸馏约5分钟，使全部蒸馏器洗涤干净。先移去三角烧瓶，再移去煤气灯，略等数秒钟，此时烧瓶1内气压下降，积聚在蒸馏瓶3内的水，被吸到管2内，开启活塞A，废液即从管2底部放出。以后每个样品蒸馏完毕，都需进行上述的洗涤过程2─3次。

　　(2)消化液的蒸馏：先打开活塞A和B，再将事先准备好的盛有5ml2%硼酸及2滴混合指示剂的三角烧瓶，放在冷凝管下端，使管口浸入液面下。

　　取蒸馏水1ml加到克氏瓶中，使与消化液混合，小心地将此溶液从漏斗倒入蒸馏瓶3中，再用少量蒸馏水洗涤克氏烧瓶，洗液也从漏斗倒入蒸馏瓶3中，如此洗涤3次。然后从漏斗加入30%NaOH7ml，用蒸馏水少许洗涤漏斗2次，每次放液时都应控制活塞B，保留少许蒸馏水于漏斗内，密封之以防逸出氨气。关闭活塞A和B，立即将烧瓶1加热沸腾，开始蒸馏。三角烧瓶中的液体由棕紫色变为蓝绿色，再继续蒸3分钟，将三角烧瓶下降，使冷凝管口离开液面约1cm，继续蒸馏1分钟。用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端，洗涤液直接流入三角烧瓶中，然后移去三角烧瓶，再移煤气灯，使蒸馏瓶3中的废液吸到管2中，开启活塞A放出废液。然后按上述步骤洗涤蒸馏器备用。

　　3．滴定

　　蒸馏完毕后，将三角烧瓶内的溶液，用0.01mol/L盐酸滴定，使溶液从蓝绿色变为淡紫色，即为终点。分别记下样品和空白所消耗的0.01mol/L盐酸ml数，分别以V_s 和V₀ 表示之。

　　4．计算

　　按下式计算样品中的蛋白质含量：

　　式中 V_s 为滴定样品用去的盐酸ml数。

　　V₀ 为滴定空白用去的盐酸ml数。

　　C为标准盐酸的摩尔浓度(mol/L)。

　　14为氮的原子量。

　　W为样品重量，mg。

　　6.25为氮－蛋白质转换系数的平均值。材料不同转换系数也不同。米粉为5.95，小麦为5.7，大麦为5.8，黑为5.8，燕麦为5.7，燕麦为5.7，玉米为5.9。

参考文献

　　1．Ewart, J. ．A. ．D.: 1967. ．J. ．Sci Food Agr., 18:548─552.

　　2．Kirk, P.L.: 1950, Anal. ．Chem., 22:254.

　　3．Lang, C. ．A.: 1958. ．Anal. ．Chem., 30:1692─1694.

Ⅱ双缩脲法

原理

　　蛋白质的肽键与碱性铜盐生成紫红色复合物，蛋白质含量不同，产生颜色的深浅也不一样，可用比色法进行测定，是一种快速测定蛋白质的方法，但其灵敏度较低，比Lowry方法要低100倍。

仪器药品

　　751型（或721型）分光光度计　　　 天平

　　恒温水浴 　　　　　　　　　　　　取样器

　　移液管 　　　　　　　　　　　　　容量瓶

　　量筒　　　　　　　　　　　　　　 烧杯

　　双缩脲试剂：依次溶解1.5g硫酸铜(CuSO₄ ·5H₂ O)和6.0g酒石酸钾钠(NakC₄ H₄ O6·4H₂ O)于500ml蒸馏水中，在不断搅拌下加入10%氢氧化钠300ml，然后用蒸馏水稀释至1000ml，密闭保存备用。

　　标准牛血清蛋白：溶解牛血清蛋白于蒸馏水中（或盐溶液或缓冲溶液，视待测样品溶液而定，以下同），配制成浓度为1.0─10μg/ml，

操作步骤

　　1．吸取不同浓度(1─10mg/ml)的标准牛血清蛋白溶液各1ml，加入双缩脲试剂4.0ml，混合均匀，于25℃水浴中保温30分钟。

　　2．用分光光度计于波长550nm读取A值，读数时以1ml蒸馏水（或缓冲溶液，视待测样品溶液性质而定）加4.0ml试剂为比色空白对照。

　　3．以蛋白质浓度为横坐标，A550为纵坐标，在毫米方格纸上绘制标准曲线，或者配以直线方程式。

　　4．用上述同样方法，测得样品的A550，然后在标准曲线图上查得样品中蛋白质含量，或用相应的直线方程式计算样品中的蛋白质含量。

参考文献

　　Gornall, A. ．G. ．et al.: 1949. ．J. ．Biol. ．Chem., 177:751─766.

Ⅲ．Folin酚试剂法

原理

　　这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为实验室所采用，也是文献上用得最多的方法之一。这种方法产生的蓝颜色，一方面是由于蛋白质与碱性铜盐产生的双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸与磷钼酸－磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。

仪器药品

　　751型分光光度计 　　　 恒温水浴

　　天平　　　　　　　　　 移液管

　　容量瓶 　　　　　　　　量筒

　　烧杯 　　　　　　　　　牛血清蛋白

　　Folin酚试剂甲：将溶液A50ml与溶液B1ml，混合之即成。用时当天配制，过期失效。

　　溶液A：1g碳酸钠溶于50ml0.1mol/L氢氧化钠中。

　　溶液B：将1%硫酸铜和2%酒石酸钠（钾）等体积混合之即成。

　　Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中，加入100g钨酸钠(Na₂ WO₄ ·2H₂ O)以及700ml蒸馏水，再加入50ml85%磷酸及100ml浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。回流完毕，加入150g硫酸锂，50ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便除去过量的溴，冷却后用蒸馏水稀释至1000ml，过滤之，滤液呈微绿色，置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准氢氧化钠滴定，以酚酞为指示剂，最后用蒸馏水稀释（约1倍左右），使最终酸度为1.0mol/L。

操作步骤

　　1．取不同浓度(10、20、40、60、80、100μg/ml)的牛血清蛋白0.6ml于试管中，分别加入试剂甲3.0ml，摇匀，置25℃水溶中保温10分钟，再加入试剂乙0.3ml，立即混匀，保温30分钟。然后于分光光度计上读取A750，以蒸馏水或缓冲溶液加试剂作为比色空白对照。将结果绘制成标准曲线，或者配以直线方程式。

　　2．用上述同样方法，测定样品溶液的A750，然后从标准曲线查得蛋白质含量，或用直线方程式计算之。

参考文献

　　1．潘家秀等：1962。蛋白质化学研究技术，科学出版社，28─29页。

　　2．Lowry, O. ．H. ．et al.: 1951. ．J. ．Biol. ．Chem., 193:265─275.

　　3．Peterson, G. ．L.: 1979. ．Anal. ．Biochem., 100:201─220.

Ⅳ．考玛斯蓝染料结合法

原理

　　植物材料中常含有能与Folin酚试剂产生颜色反应的物质如酚类、游离氨基酸等，往往使得测定值比实际含量来得高。利用有些染料能使蛋白质染色的特性，发展成一种简单而快速的测定蛋白质的方法，操作方便，适合于大量样品的分析，灵敏度与Lowry法相似，且不受游离氨基酸和小肽的影响。

仪器药品

　　751型分光光度计　　 分析天平

　　取样器　　　　　 　 容量瓶

　　移液管

　　标准牛血清蛋白溶液：称取牛血清蛋白10mg，溶于100ml蒸馏水中，使浓度为100μg/ml。

　　染料试剂：称取考玛斯蓝G－250(Coomassie brilliant blue G─250) 60mg，溶于100ml3%过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，贮于棕色瓶中。

操作步骤

　　1．以系列不同浓度(1─50μg)的标准牛血清蛋白溶液2ml，分别加入染料试剂2ml，立即混匀，于分光光度计波长620nm测定A₆₂₀ 。以蒸馏水2ml加染料试剂2ml，作为比色空白对照。

　　2．用上述同样的方法，测定样品溶液的A620。然后从标准曲线查得蛋白质浓度，或者根据直线方程计算之。

参考文献

　　1．李琳、焦新之：1980。应用蛋白染色剂考玛斯蓝G－250测定蛋白质的方法，植物生理学通讯，1980(6)：52─55。

　　2．Bradford, M. ．M.: 1976. ．Anal. ．Biochem., 72:248─254.

　　3．Sedmak, J. ．J. ．and S. ．E. ．Grossberg : 1977. ．Anal. ．Biochem., 79:544─552.

Ⅴ．紫外吸收法

原理

　　大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm。Warburg等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。样品不需要经过预先处理，即可直接进行测定。方法简单而快速，又不损害样品中的蛋白质，测定之后的样品仍可作他用。样品中有硫酸或其他盐类存在也不影响测定。在柱层析分离酶或蛋白质时，常为人们所采用。

　　该方法是以酵母烯醇酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来误差。

仪器药品

　　751型分光光度计

操作步骤

　　1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于751型分光光度的计波长280nm和260nm，分别读取A₂₈₀ 和A₂₆₀ 。用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白对照。

　　2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。

蛋白质含量(mg/ml)=1.55A₂₈₀ ─0.76A₂₆₀