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实验56 蛋白质含量的测定

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1882

实验56 蛋白质含量的测定

  在研究植物的营养、代谢作用以及生长发育等生命活动时,往往需要测定样品中的蛋白质含量,测定蛋白质的方法有许多,不同的测定方法,乃根据蛋白质的不同理化特性,而不同的蛋白质由于结构不同、组成分不同,它们的理化特性也就很不相同,对不同的测定方法反应也就很难一致,因此,可以说没有一种测定方法在各种条件下都能适用。所以当你选用某一测定方法时,应该注意到:

  (1)该方法所依据的原理是什么?(2)检测的灵敏度如何?(3)对不同蛋白质的反应有无差异?(4)有哪些因素会干拢测定?

  下面列举几种在文献上常用的测定方法。

Ⅰ.微量克氏定氮法

原理

  蛋白质是含氮有机物,自然界中的蛋白质含氮比较稳定,平均含量约为165,即100g蛋白质平均含氮16g。因此在测定生物样品的蛋白质含量时,可先测定样品中的含氮量,再乘以系数6.25,便可换算成蛋白质含量。克氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法。

  样品用浓硫酸消化时,其中的含氮有机物分解放出氨,氨与硫酸化合生成硫酸铵。在消化时常加入硫酸铜和硫酸钾作催化剂,以加速分解速度并提高消化的温度。消化完华,加入强碱使消化液中的硫酰铵分解,放出氨。利用蒸汽蒸馏法,用硼酸溶液吸收蒸馏出来的氨,氨与硼酸溶液中的氢离子结合生成离子,使吸收液中的氨离子浓度下降,然后用标准酸溶液滴定,使吸收液中的氢离子恢复到原先的浓度,即可从消耗的酸量,计算样品中的含氮量。

  消化,蒸馏的化学反应可归纳如下:

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(NH4 )2 SO4 2NaOH→2NH3↑ Na2 SO4 2H2 O

仪器药品

  克氏蒸馏器     克氏烧瓶

  消化架       三角烧瓶

  滴定管       移液管

  量筒        烧杯

  天平        2%硼酸

  浓硫酸

  催化剂:硫酸铜和硫酸钾按3∶1混合,研细。

  混合指示剂:0.1%溴甲酚绿酒精溶液10ml,0.1%甲基红酒精溶液2ml,混合即得,贮于棕色瓶内。

操作步骤

  1.样品的消化

  (1)在分析天平上准确称取植物样品干粉(40─60目过筛)100─500mg(视样品中含氮量而定)2份。

  (2)取50ml克氏烧瓶3只,将称好的样品分别送入第1、2只烧瓶底部,第3只烧瓶不加样品,作为空白对照,以测定试剂中的微量含氮化合物。于各个烧瓶中加入催化剂0.3g,浓硫酸5ml,然后将烧瓶置于通风橱消化架上,先用小火加热,待瓶内水分蒸完,硫酸开始放出SO2 白烟,可加大火焰,使液体保持微沸状,直至溶液呈透明蓝绿色为止。在消化过程中,要经常转动烧瓶,使得瓶壁上的碳化颗粒,为浓硫酸回流至瓶底,使消化完全。为了缩短消化时间,当溶液变为浅棕色时,可加3─4滴30%过氧化氢。

  消化完毕,冷却,待蒸馏。

  2.氨的蒸馏

  (1)蒸馏装置的洗涤:先用自来水将克氏定氮仪清洗干净,按图19装置好。在蒸汽发生瓶中(烧瓶1)加入约2/3体积的蒸馏水,加入浓硫酸数滴(在酸性情况下,水中氨不会蒸馏出来)及沸石(或毛细管数根)使沸腾均匀,关闭活塞A和B,将烧瓶1中的水煮沸,使蒸汽充分洗涤仪器,并检查装置的各个部分有无漏气现象,然后打开活塞B,让蒸汽洗涤漏斗约5分钟,再将活塞B关闭,继续蒸馏约5分钟,使全部蒸馏器洗涤干净。先移去三角烧瓶,再移去煤气灯,略等数秒钟,此时烧瓶1内气压下降,积聚在蒸馏瓶3内的水,被吸到管2内,开启活塞A,废液即从管2底部放出。以后每个样品蒸馏完毕,都需进行上述的洗涤过程2─3次。

  (2)消化液的蒸馏:先打开活塞A和B,再将事先准备好的盛有5ml2%硼酸及2滴混合指示剂的三角烧瓶,放在冷凝管下端,使管口浸入液面下。

  取蒸馏水1ml加到克氏瓶中,使与消化液混合,小心地将此溶液从漏斗倒入蒸馏瓶3中,再用少量蒸馏水洗涤克氏烧瓶,洗液也从漏斗倒入蒸馏瓶3中,如此洗涤3次。然后从漏斗加入30%NaOH7ml,用蒸馏水少许洗涤漏斗2次,每次放液时都应控制活塞B,保留少许蒸馏水于漏斗内,密封之以防逸出氨气。关闭活塞A和B,立即将烧瓶1加热沸腾,开始蒸馏。三角烧瓶中的液体由棕紫色变为蓝绿色,再继续蒸3分钟,将三角烧瓶下降,使冷凝管口离开液面约1cm,继续蒸馏1分钟。用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端,洗涤液直接流入三角烧瓶中,然后移去三角烧瓶,再移煤气灯,使蒸馏瓶3中的废液吸到管2中,开启活塞A放出废液。然后按上述步骤洗涤蒸馏器备用。

  3.滴定

  蒸馏完毕后,将三角烧瓶内的溶液,用0.01mol/L盐酸滴定,使溶液从蓝绿色变为淡紫色,即为终点。分别记下样品和空白所消耗的0.01mol/L盐酸ml数,分别以Vs 和V0 表示之。

  4.计算

  按下式计算样品中的蛋白质含量:

  式中 Vs 为滴定样品用去的盐酸ml数。

  V0 为滴定空白用去的盐酸ml数。

  C为标准盐酸的摩尔浓度(mol/L)。

  14为氮的原子量。

  W为样品重量,mg。

  6.25为氮-蛋白质转换系数的平均值。材料不同转换系数也不同。米粉为5.95,小麦为5.7,大麦为5.8,黑为5.8,燕麦为5.7,燕麦为5.7,玉米为5.9。

参考文献

  1.Ewart, J. .A. .D.: 1967. .J. .Sci Food Agr., 18:548─552.

  2.Kirk, P.L.: 1950, Anal. .Chem., 22:254.

  3.Lang, C. .A.: 1958. .Anal. .Chem., 30:1692─1694.

Ⅱ双缩脲法

原理

  蛋白质的肽键与碱性铜盐生成紫红色复合物,蛋白质含量不同,产生颜色的深浅也不一样,可用比色法进行测定,是一种快速测定蛋白质的方法,但其灵敏度较低,比Lowry方法要低100倍。

仪器药品

  751型(或721型)分光光度计    天平

  恒温水浴             取样器

  移液管              容量瓶

  量筒               烧杯

  双缩脲试剂:依次溶解1.5g硫酸铜(CuSO4 ·5H2 O)和6.0g酒石酸钾钠(NakC4 H4 O6·4H2 O)于500ml蒸馏水中,在不断搅拌下加入10%氢氧化钠300ml,然后用蒸馏水稀释至1000ml,密闭保存备用。

  标准牛血清蛋白:溶解牛血清蛋白于蒸馏水中(或盐溶液或缓冲溶液,视待测样品溶液而定,以下同),配制成浓度为1.0─10μg/ml,

操作步骤

  1.吸取不同浓度(1─10mg/ml)的标准牛血清蛋白溶液各1ml,加入双缩脲试剂4.0ml,混合均匀,于25℃水浴中保温30分钟。

  2.用分光光度计于波长550nm读取A值,读数时以1ml蒸馏水(或缓冲溶液,视待测样品溶液性质而定)加4.0ml试剂为比色空白对照。

  3.以蛋白质浓度为横坐标,A550为纵坐标,在毫米方格纸上绘制标准曲线,或者配以直线方程式。

  4.用上述同样方法,测得样品的A550,然后在标准曲线图上查得样品中蛋白质含量,或用相应的直线方程式计算样品中的蛋白质含量。

参考文献

  Gornall, A. .G. .et al.: 1949. .J. .Biol. .Chem., 177:751─766.

Ⅲ.Folin酚试剂法

原理

  这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一,由于方法简便,灵敏度高,常为实验室所采用,也是文献上用得最多的方法之一。这种方法产生的蓝颜色,一方面是由于蛋白质与碱性铜盐产生的双缩脲反应,同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸与磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比,可用比色法测定。

仪器药品

  751型分光光度计     恒温水浴

  天平          移液管

  容量瓶         量筒

  烧杯          牛血清蛋白

  Folin酚试剂甲:将溶液A50ml与溶液B1ml,混合之即成。用时当天配制,过期失效。

  溶液A:1g碳酸钠溶于50ml0.1mol/L氢氧化钠中。

  溶液B:将1%硫酸铜和2%酒石酸钠(钾)等体积混合之即成。

  Folin酚试剂乙:在1.5L容积的磨口回流瓶中,加入100g钨酸钠(Na2 WO4 ·2H2 O)以及700ml蒸馏水,再加入50ml85%磷酸及100ml浓盐酸,充分混合,接上回流冷凝管,以小火回流10小时。回流完毕,加入150g硫酸锂,50ml蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便除去过量的溴,冷却后用蒸馏水稀释至1000ml,过滤之,滤液呈微绿色,置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准氢氧化钠滴定,以酚酞为指示剂,最后用蒸馏水稀释(约1倍左右),使最终酸度为1.0mol/L。

操作步骤

  1.取不同浓度(10、20、40、60、80、100μg/ml)的牛血清蛋白0.6ml于试管中,分别加入试剂甲3.0ml,摇匀,置25℃水溶中保温10分钟,再加入试剂乙0.3ml,立即混匀,保温30分钟。然后于分光光度计上读取A750,以蒸馏水或缓冲溶液加试剂作为比色空白对照。将结果绘制成标准曲线,或者配以直线方程式。

  2.用上述同样方法,测定样品溶液的A750,然后从标准曲线查得蛋白质含量,或用直线方程式计算之。

参考文献

  1.潘家秀等:1962。蛋白质化学研究技术,科学出版社,28─29页。

  2.Lowry, O. .H. .et al.: 1951. .J. .Biol. .Chem., 193:265─275.

  3.Peterson, G. .L.: 1979. .Anal. .Biochem., 100:201─220.

Ⅳ.考玛斯蓝染料结合法

原理

  植物材料中常含有能与Folin酚试剂产生颜色反应的物质如酚类、游离氨基酸等,往往使得测定值比实际含量来得高。利用有些染料能使蛋白质染色的特性,发展成一种简单而快速的测定蛋白质的方法,操作方便,适合于大量样品的分析,灵敏度与Lowry法相似,且不受游离氨基酸和小肽的影响。

仪器药品

  751型分光光度计   分析天平

  取样器        容量瓶

  移液管

  标准牛血清蛋白溶液:称取牛血清蛋白10mg,溶于100ml蒸馏水中,使浓度为100μg/ml。

  染料试剂:称取考玛斯蓝G-250(Coomassie brilliant blue G─250) 60mg,溶于100ml3%过氯酸溶液中,滤去未溶解的染料,贮于棕色瓶中。

操作步骤

  1.以系列不同浓度(1─50μg)的标准牛血清蛋白溶液2ml,分别加入染料试剂2ml,立即混匀,于分光光度计波长620nm测定A620 。以蒸馏水2ml加染料试剂2ml,作为比色空白对照。

  2.用上述同样的方法,测定样品溶液的A620。然后从标准曲线查得蛋白质浓度,或者根据直线方程计算之。

参考文献

  1.李琳、焦新之:1980。应用蛋白染色剂考玛斯蓝G-250测定蛋白质的方法,植物生理学通讯,1980(6):52─55。

  2.Bradford, M. .M.: 1976. .Anal. .Biochem., 72:248─254.

  3.Sedmak, J. .J. .and S. .E. .Grossberg : 1977. .Anal. .Biochem., 79:544─552.

Ⅴ.紫外吸收法

原理

  大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在,在紫外光280nm有吸收高峰,可以进行蛋白质含量的测定。但是核酸在280nm也有吸收,干扰测定,不过核酸的最大吸收峰在260nm。Warburg等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280nm和260nm时A的比值,然后通过计算消除核酸存在的影响,可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。样品不需要经过预先处理,即可直接进行测定。方法简单而快速,又不损害样品中的蛋白质,测定之后的样品仍可作他用。样品中有硫酸或其他盐类存在也不影响测定。在柱层析分离酶或蛋白质时,常为人们所采用。

  该方法是以酵母烯醇酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式,而不同蛋白质的氨基酸组成也不同,因而光吸收也不尽相同,这就会带来误差。

仪器药品

  751型分光光度计

操作步骤

  1.取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中,于751型分光光度的计波长280nm和260nm,分别读取A280 和A260 。用蒸馏水(缓冲溶液或盐溶液,视样品溶液而定)为比色空白对照。

  2.根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。

蛋白质含量(mg/ml)=1.55A280 ─0.76A260

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