蛋白质糖基化分析

蛋白质实验

最新修订时间：2022-10-10

简介

蛋白质的糖基化（glycosylation）是目前已知最为复杂的蛋白质翻译后修饰，由 8 种单糖参与构成的各种复杂寡糖链与蛋白质连接形成。蛋白质糖基化分析包括：蛋白质是否发生了糖基化及糖基连接形式、糖基化位点分析和糖链结构分析。

蛋白质糖基化分析的方法主要有两种：内切糖苷酶分析 N－连接寡糖和糖基化抑制剂用千鉴定糖蛋白。

原理

蛋白质糖基化的基本原理是：寡糖中的 N－乙酰葡糖胺与多肽链中天冬酰胺残基的酰胺氮连接，形成 N－连接糖蛋白；寡糖中的 N－乙酰半乳糖胺与多肽链的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基相连则形成 O－连接糖蛋白。糖蛋白可分布于细胞表面、细胞内分泌颗粒和细胞核内，也可被分泌到细胞外构成细胞外基质。真核细胞内大约 50％的蛋白质属于糖蛋白（glycoprotein）蛋白质糖基化所形成的糖链一般含有 1015 个单糖基，理论上计算会产生大抵的异构体。

来源：丁香实验团队

操作方法

内切糖苷酶分析 N－连接寡糖

如果蛋白质分子中有糖链存在，在体外使用可去除蛋白质中的 N－连接寡糖的内切糖苷酶（endoglycosidase）、糖胺酶（glycosamidase）或者可去除 O－连接寡糖的 O－糖苷酶 O－glycosidase）处理样品，然后和未经处理的样品共同进行 SDS－PAGE，不含糖链的蛋白质的电泳迁移率会高于糖基化蛋白。因此，对这些酶的敏感性可用于检测 N－连接寡糖或 O－连接寡

糖基化抑制剂用千鉴定糖蛋白

鉴定糖基化及寡糖链结构的另一种方法是在糖基化反应过程中使用抑制剂。有的抑制剂作用在糖基化的早期阶段，如衣霉素（tunicamycin），可阻止所有 N－连接寡糖链的形成。

蛋白质糖基化

质谱：① 细胞或组织蛋白抽提；② 糖蛋白富集分离；③ N-,O- 聚糖水解；④ 聚糖的甲基化；⑤ 基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析天然和甲基化的聚糖；⑥ 串联质谱确定糖基结构。