简介
鉴定糖基化及寡糖链结构的另一种方法是在糖基化反应过程中使用抑制剂。 有的抑制剂作用在糖基化的早期阶段，如衣霉素（tunicamycin）， 可阻止所有 N－ 连接寡糖链的形成。
原理
糖基化抑制剂用千鉴定糖蛋白的基本原理如下：在衣霉素存在下，细胞内的糖基化可以完全被抑制。 有的抑制剂则在寡糖链形成过程中发挥作用，在某些特定的步骤阻止糖链的合成，形成不同的糖链结构，因而可以利用该类抑制剂，确定一些糖链结构的存在与否及其对于糖蛋白功能的影响。
材料与仪器
试剂：
1、细胞裂解缓冲液： 50 mmol/L Tris－HCI （ pH 7.4）， 100 mmol/L NaCI， 1％ NP－40 ， 1％ DOC， 0.1％ SDS， 10 mmol/L EDTA，临用前加入 1 mg/ml leupeptin 和 aprotinin， 200 mmol/L Na3VO4 和 1 mmol PMSF。
2、细胞裂解液，包含蛋白酶、磷酸酶制剂的非离子去垢剂裂解液。
3、SDS－PAGE 上样缓冲液
4、HCL，6mol/L
5、磷酸氨基酸标准品，包含非放射性磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸混合。
6、 pH 1.9 电泳缓冲液：50 ml 88％ 甲酸， 156 ml 冰乙酸， 1794 ml H2O， 密封室温保存。
7、pH 3.5 电泳缓冲液：100 ml 冰乙酸， 10 ml 嘧啶， 10 ml 100 mmol/L EDTA， 1880 ml H2O，密封室温保存。
8、 0.25％ 茚三酮丙酮溶液
步骤
糖基化抑制剂用千鉴定糖蛋白的基本流程如下：
A、将新鲜细胞分到 100 mm 含完全培养基的组织培养板上，培养 24 h。
B、吸出培养基（将悬浮细胞离心），加入足量的标记培养基，以覆盖细胞（约 5 ml） 按预先确定的最佳浓度加入抑制剂，同时设不含抑制剂的对照。虽然没有实质性影响 ，但还是建议将细胞与抑制剂进行 24 h 的预培养，保证在细胞表面表达有足够比例的聚糖结构发生改变的糖蛋白。
C、加入 [3 H]－甘露糖至 0.14～3.7 MBq/ml， 培养 412 h。 将细胞收取至冰冷的 PBS 中。
D、冷 PBS 洗涤细胞 2 次。 将细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液 （5 x 107 cells/ml） 中，4 ℃ 温育 1 h。
E、 4°C、 3000 g 离心 10 min， 去除细胞核，上清于 100000 g 离心 1 h。 保存上清，在几天内使用或 －70 ℃ 保存。
F、将每一样品分成 2 等份，加在圆底聚丙烯离心管中， 加入 8 倍体积的冷丙酮（－20 ℃），轻缓混匀 。－20 ℃ 沉淀过夜。4 ℃、 3000 g 离心 15 min， 小心倒出丙酮。
短暂离心，将残留丙酮移去 让沉淀自然干燥。
G、重悬细胞沉淀，每 10 个细胞加入 20～40 微升的 Endo H 消化缓冲液， 95 ℃ 作用 10 min， 使内源性水解酶失活，然后按每 100 ul 样品 5ul 的比例加入 Endo H， 37 °C 温育过夜。
H、加入 1/10 体积 20％ SDS， 煮沸 3～5 min。每次加一个样品至 Sephacryl S－200 柱（预先用 25 mmol/L 甲酸胺 /0.1％ SDS 平衡），上样体积不超过柱床体积的 5％。收集洗脱液，在 2 次上样间隙用 2～4 倍体积的 25 mmol/L 甲酸胺 /0.1 SDS 洗柱。
I、用闪烁计数器分别测定糖蛋白 ［在外水体积（V0）洗脱下来的］ 和游离寡糖（在 V0 之后洗脱）的放射性强度。
注意事项
所有操作需要在放射性核素操作专用实验室进行，并严格执行相关规定。
来源：丁香实验
