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蛋白质糖基化

相关实验:蛋白质糖基化分析

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审核专家 | 赵玉洁博士

生理学 厦门大学

原理

糖基化修饰是蛋白翻译后修饰方式之一,糖基化是在糖基转移酶作用下将糖基转移至蛋白质与蛋白质上氨基酸残基形成糖苷键,并在糖苷酶的加工下形成多种糖链的过程。

糖基化可以发生在丝氨酸或苏氨酸侧链羟基上,也可以发生在天冬酰胺侧链氨基上,而每一个修饰位点的糖链可能存在不同的类型,其中包含 O - 连接糖基化和 N - 连接糖基化(高甘露唐型、杂合型和复杂型)修饰。

糖蛋白在细胞信号转导、免疫应答、癌症等许多重要的生物学过程中发挥重要作用。

用途

糖蛋白鉴定、糖基化位点鉴定

材料与仪器

质谱-蛋白酶;糖链富集亲和色谱柱;高级液相色谱仪;质谱仪。

步骤

质谱:

① 细胞或组织蛋白抽提;

② 糖蛋白富集分离;

③ N-,O- 聚糖水解;

④ 聚糖的甲基化;

⑤ 基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析天然和甲基化的聚糖;

⑥ 串联质谱确定糖基结构。

注意事项

糖链分离富集亲和技术有多种需根据不同的富集方法开展实验

常见问题

1、对于凝集素亲和富集糖蛋白,此方法根据凝集素特异性识别结合一类或几类特异糖基的性质对糖蛋白进行分离纯化(刀豆凝集素富集高甘露糖型糖肽、蓖麻凝集素富集含 β-1, 4- 连接半乳糖的糖肽),

步骤:样品经凝集素亲和层析,酶解,二次亲和层析,高级液相色谱分离,质谱测序;

2、肼化学富集法,酰肼试剂修饰经氧化处理的糖;

3、亲水色谱法利用糖链加入亲水性增强原理富集糖肽;

4、β 消除米式加成反应可在修饰位点处连接反应活性强的巯基进而富集糖肽;

5、PNGase F 酶广泛用于 N 糖蛋白鉴定。

来源:丁香实验

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