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内切糖苷酶分析 N- 连接寡糖

相关实验:蛋白质糖基化分析

最新修订时间:

简介

如果蛋白质分子中有糖链存在,在体外使用可去除蛋白质中的 N- 连接寡糖的内切糖苷酶 (endoglycosidase) 、糖胺酶 (glycosamidase) 或者可去除 O-连接寡糖的 O-糖苷酶 O-glycosidase) 处理样品,然后和未经处理的样品共同进行 SDS-PAGE, 不含糖链的蛋白质的电泳迁移率会高于糖基化蛋白。因此,对这些酶的敏感性可用于检测 N- 连接寡糖或 O-连接寡糖的存在。

原理

内切糖苷酶分析 N- 连接寡糖的基本原理是:N- 糖苷酶和 肽 N- 糖苷酶 (Glycopeptidase F,GPase F) 可以将糖链从天然或变性蛋白质 的肽链骨架上完整地切割下来,去除所有的 N-连接寡糖链。切割作用发生在最靠近天冬酰胺的糖与氨基酸的连接处。

材料与仪器

试剂:

1、蛋白质 A-琼脂糖珠

2、 0.1 mol/L 的 2-ME/0.1% SDS

3、0.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.6)

4、10% NP-40

5、200-250 mU/ ml PNGase F

6、0.5mol/L Tris-HCl

步骤

内切糖苷酶分析 N- 连接寡糖的基本过程可分为如下几步:

A、 [ 35 S ]- 甲硫氨酸示踪标记细胞,裂解细胞后,用特异性抗体沉淀拟检测糖基化的目标蛋白,用蛋白质 A- 琼脂糖珠收集抗原抗体复合物。

B、 在微量离心管中,向结合着抗原抗体复合物的琼脂糖珠中加入 20-30 ul 0.1 mol/L 的 2-ME/ 0.1 % SDS, 充分混匀, 90 °C 3~5 min, 冷却后于 1000 g 离心 1 min。 将含有变性蛋白质的上清移至洁净的微量离心管内。

C、取 10 ul 变性蛋白质上清,依次加入 3 微升 0.5 mol/ L Tris-HCl (pH 8.6) 、5 ul H2O、 2 ul 10% NP-40、 5 ul 200-250 mU/ ml PNGase F, 每加 1 种试剂后要混匀。 对照管内以 5 ul 0.5 mol/L Tris -HCl 代替酶。

D、 37 ℃ 温育过夜。

E、加入 2.5 ul 10 X SDS 样品缓冲液, 90 ℃ 5 min, 使 PNGase F 失活。


F、 SDS-PAGE 分离蛋白质,放射自显影。 电泳迁移率的增加表明存在 N-连接寡糖链。


注意事项

可以用 pH 7.0 的磷酸钠或 HEPES 缓冲液代替 Tris- HCl, 不能使用含钾盐的缓冲液, 因其引起 SDS 沉淀。

来源:丁香实验

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