内切糖苷酶分析 N－连接寡糖

最新修订时间：2022-02-10

简介

如果蛋白质分子中有糖链存在，在体外使用可去除蛋白质中的 N－连接寡糖的内切糖苷酶（endoglycosidase）、糖胺酶（glycosamidase）或者可去除 O－连接寡糖的 O－糖苷酶 O－glycosidase）处理样品，然后和未经处理的样品共同进行 SDS－PAGE，不含糖链的蛋白质的电泳迁移率会高于糖基化蛋白。因此，对这些酶的敏感性可用于检测 N－连接寡糖或 O－连接寡糖的存在。

原理

内切糖苷酶分析 N－连接寡糖的基本原理是：N－糖苷酶和肽 N－糖苷酶（Glycopeptidase F，GPase F）可以将糖链从天然或变性蛋白质的肽链骨架上完整地切割下来，去除所有的 N－连接寡糖链。切割作用发生在最靠近天冬酰胺的糖与氨基酸的连接处。

材料与仪器

试剂：

1、蛋白质 A－琼脂糖珠

2、 0.1 mol/L 的 2－ME/0.1％ SDS

3、0.5 mol/L Tris－HCl （pH 8.6）

4、10％ NP－40

5、200－250 mU/ ml PNGase F

6、0.5mol/L Tris－HCl

步骤

内切糖苷酶分析 N－连接寡糖的基本过程可分为如下几步：

A、［ 35 S ］－甲硫氨酸示踪标记细胞，裂解细胞后，用特异性抗体沉淀拟检测糖基化的目标蛋白，用蛋白质 A－琼脂糖珠收集抗原抗体复合物。

B、在微量离心管中，向结合着抗原抗体复合物的琼脂糖珠中加入 20－30 ul 0.1 mol/L 的 2－ME/ 0.1 ％ SDS，充分混匀， 90 °C 3～5 min，冷却后于 1000 g 离心 1 min。将含有变性蛋白质的上清移至洁净的微量离心管内。

C、取 10 ul 变性蛋白质上清，依次加入 3 微升 0.5 mol/ L Tris－HCl （pH 8.6）、5 ul H2O、 2 ul 10％ NP－40、 5 ul 200－250 mU/ ml PNGase F，每加 1 种试剂后要混匀。对照管内以 5 ul 0.5 mol/L Tris －HCl 代替酶。

D、 37 ℃ 温育过夜。

E、加入 2.5 ul 10 X SDS 样品缓冲液， 90 ℃ 5 min，使 PNGase F 失活。

F、 SDS－PAGE 分离蛋白质，放射自显影。电泳迁移率的增加表明存在 N－连接寡糖链。

注意事项

可以用 pH 7.0 的磷酸钠或 HEPES 缓冲液代替 Tris－ HCl，不能使用含钾盐的缓冲液，因其引起 SDS 沉淀。

来源：丁香实验

内切糖苷酶分析 N－ 连接寡糖

内切糖苷酶分析 N－连接寡糖