植物蛋白质组学和糖基化
丁香园
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1. 前言
与其他真核细胞一样，植物细胞中，糖基化通常发生在分泌蛋白质上，虽然在细胞质蛋白和核蛋白上也发现一些糖基化反应。根据寡糖部分和蛋白质骨架之间的连接方式，可将糖基化分为两种类型：N -糖基化和 O-糖基化。植物中 N-糖基化研究最多。
1.1 N-糖基化
与其他真核细胞一样，在植物细胞中，N-糖基化只发生在进入分泌途径的蛋白质上。它从内质网中的寡聚糖前体 Glc3Man9GlcNAC2 共翻译转移到构成初生蛋白质 ( Asn-X-Ser/Thr，X 可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一种氨基酸）N--糖基化序列的特异天冬酰胺残基上开始，当新合成的蛋白质进入内质网腔后就发生 N 端序列糖基化反应（图 25-1B )。接着，当糖蛋白从内质网经高尔基体到达其最终目的地时，Glc3Man9GlcNAC2 前体沿着分泌途径进行进一步加工处理。如果糖基侧链能被内质网和高尔基体中的糖苷酶和糖基转移酶加工的话，Glc3Man9GlcNAc2 前体就会被成功转化为 Man9GlcNAc2 和 Man5GlcNAC2 范围内的髙甘露糖型 N-聚糖（图 25-1A)， 以及复杂形式的 N-聚糖。植物复杂形式 N-糖苷有一个挂在中心的近端氨基葡糖上的 α-1-3 岩藻糖；一个与中心少甘露糖连接的 β-1-2 木糖残基，和/或与它们的末端天线（称为 Lewisa ) 连接的 Gal/β-3 (Fucα-1-4 ) GlcNAc 寡聚糖末端序列，称为 Lewisa ( 图 25-1B ) [1] 。
1. 2 O-糖基化
在植物细胞中 O-糖基化可分为两种类型。即分泌蛋白糖基化或细胞质/核蛋白糖基化。蛋白质上不同位点的 O-连聚糖的性质不同。
1. 分泌蛋白质的 O-糖基化
对植物分泌蛋白的 O-糖基化的了解还很少。只有少数几篇文章报道了与植物糖蛋白上的一些丝氨酸或苏氨酸残基连接的 O-聚糖。一些糖蛋白，如细胞壁伸展蛋白和液泡中的甘薯贮藏蛋白（sporamin) 都被认为是一类含有一个单半乳糖 O-糖基化的丝氨酸残基的糖蛋白 [ 2，3] 。分析鉴定水稻被转运到液泡的谷蛋白也是为了证明哺乳动物黏蛋白型糖基化的存在，植物中这一类型 O-糖基化依然存在争议 [4] 。第二种类型的分泌蛋白 O-糖基化要求糖蛋白脯氨酸残基的羟基化，我们已发现植物中的富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGP)。HRGP 是植物中主要表面糖蛋白。这些定位于细胞壁或细胞质膜外表面的 HRGP，有三类蛋白质：伸展蛋白，阿拉伯半乳糖链蛋白（AGP ) 和茄科凝集素 ( 图 25-2)。伸展蛋白和茄科凝集素含有由丝氨酸- ( 羟脯氨酸 )4 组成的重复序列，这里 的丝氨酸可被 O-糖基化，而羟脯氨酸可被阿拉伯糖链取代 [5] 。这个阿拉伯糖化过程在髙尔基体中发生 [6]。AGP 家族是那些高糖基化的胞外蛋白和细胞质膜蛋白质。其蛋白质部分富含羟脯氨酸（Hyp) 、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸和甘氨酸，并含有 Ala-Hyp 重复序列。脯氨酰-4-羟化酶的催化作用可将内质网和/或高尔基体中脯氨酸转换成羟脯氨酸 [ 4，7 ] 。AGP 的 O-糖基化过程是一种添加了被 β-1-6 半乳糖支链取代 β-1-3 半乳糖数组的半寡聚糖支链的羟脯氨酸后的循序渐进的方式，β-1-6 半乳糖支链反过来由阿拉伯糖或者其他的低丰度的单糖依次形成分支（图 25 -2)。
2. O-GlcNAc 糖基化修饰
另外一种在哺乳动物中得到详细阐述的 O-糖基化形式是细胞质和细胞核蛋白的 O-GlcNAc 糖基化。这种在蛋白质上添加 O-GlcNAc 的修饰，在真核生物中非常普遍，发生在丝氨酸或苏氨酸的 β-连接上。尽管序列 Tyr-Ser-Pro-Tb- Ser- Pro -Sef ( 标有 _是发生糖基化的氨基酸）代表一类典型的 GlcNAc 连接位点 [9] ，但是对可被 OGlcNAc 糖基化的保守序列还不十分清楚。OGlcNAc 糖基化是一种高度动态过程，而且通常与 O-磷酸化修饰交互进行 [10] 。糖基转移酶的催化作用下，糖基被添加到蛋白质上，而在 OGlcNAc 糖苷酶的催化作用下，糖基被从蛋白质上移除许多细胞活动过程，如蛋白转运入细胞核、转录、细胞骨架附着在细胞膜上或蛋白合成等都参与了这个糖基化修饰，目前对它的确切作用还了解不多。
植物中有关 OGlcNAc 糖基化的报道还很少，与 OGlcNAc 转移酶相似的两个被命名为 SPINDLY 和 SEC 的酶已在拟南芥中克隆出来 [ 11，13] 。它们在离体条件下具有 OGlcNAc 转移酶活性，但还不清楚它们在植物体内的天然底物。此外，有报道将一些细胞核蛋白描述为携带末端为 GlcNAc 的 O-连聚糖的糖蛋白 [14，15 ] 。这些细胞核蛋白是否为 SPIN-DLY 和 SEC 的底物仍是个谜。
1.3 糖基化的异质性
真核细胞的成熟分泌糖蛋白 N-糖基化模式是内质网中的寡聚糖共翻译转运过程和其在内质网和高尔基体内加工的共同结果。多肽折叠因子会影响内质网内潜在糖基化位点 [16] 。结果导致蛋白质中的多个 N-糖基化位点中有些位点为无效糖基化位点，其他一些则未能完全糖基化 [17~19] 。
同时，多糖侧链的修饰加工与其是否接触到成熟的酶相关。虽然被包被在蛋白分子结构内部的寡糖仍然是未修饰的高甘露糖型 N-糖链，但位于蛋白质表面的糖苷将成熟转变为复杂形式的 N-糖苷 [17] 。这种现象也同样发生在 O-糖苷上。因此，要鉴定植物糖蛋白的糖基化，不仅需要鉴定糖-蛋白连接及附着在糖蛋白上的寡聚糖的结构，而且还要确定其在蛋白分子骨架上的潜在糖基化位点的分布/定位。
本章的目的是向植物蛋白质组学工作者介绍一些工具和方法，用于确定所鉴定的蛋白是否为糖蛋白，类别以及蛋白骨架上糖苷侧链的位置。本章的最后部分将论述植物糖蛋白质组学中的糖蛋白鉴定方法。
2. 材料
2.1 这个蛋白是糖蛋白吗
DIG 糖链检测试剂盒（Roche Applied Science， Mannheim，Germany) ( 保存于 2~8°C )
2.2 我的蛋白是怎样被糖基化的
1. 应用 Western 印记杂交检测糖苷
1 ) 凝集素亲和检测方法
( 1 ) TTBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl 和 0.1% Tween-20。
( 2 ) Lectin- biotin：GNA ( 雪花莲凝集素）-生物素（Vector Labs/Abcys，France) ( 保存于 2~8°C ) 和 WGA ( 麦胚凝集素)-生物素（Sigma Aldrich，Lyon，France) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 3 ) 链霉亲和素-过氧化物酶（Amersham Biosciences/GE，Healthcare，Uppsala，Sweden) ( 保存于 2~8℃）。
( 4 ) TBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl。
( 5 ) 4-氯-1- 萘酚（Bio- Rad，Hercules，CA ) ( 保存于 -20°C )。
( 6 ) 牛胰核糖核酸酶 B ( Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C) 。
( 7 ) 甲基比喃甘露糖苷（Sigma Aldrich ) ( 室温保存）。
( 8 ) 牛晶状体 α-A-晶体蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 -70°C ) 。
( 9 ) 卵清白蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8℃ ) 。
( 10 ) TTBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2；1 mmol/L MgCl2 和 0.1% Tween-20。
( 11 ) 刀豆球蛋白 A ( Sigma Aldrich) ( 保存于 5~8°C ) 。
( 12 ) 辣根过氧化物酶（HRP；Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 13 ) 大豆凝集素（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8℃）。
2 ) 特异抗体免疫检测方法
( 1 ) TBS 缓冲液：20 mmol/L Tris -HCl，pH 7.4，含 0. 5 mol/L NaCl。
( 2 ) 明胶（Bio- Rad) 。
( 3 ) 抗 HRP 免疫兔血清 （Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 4 ) 抗蜂毒抗体（蜂毒， Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 5 ) 鼠抗人 Lewisa 单克隆抗体（Calbiochem， Meudon， France) ( 保存于 -20℃）。
( 6 ) TTBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl 和 0.1% Tween -20。
( 7 ) 羊抗鼠免疫球蛋白辣根过氧化酶标记抗体（Sigma Aldrich) ( 保存于 -20°C ) 。
( 8 ) 羊抗兔免疫球蛋白辣根过氧化酶标记抗体（Bio- Rad ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 9 ) 来源于蜂毒的磷脂酶 A2 ( agm aAldrich ) ( 保存于 2~8°C) 。
( 10 ) 菜豆凝集素（PHA-L；Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 11 ) 玉米中表达的重组抗生物素蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
2. 糖苷的单糖组分分析
( 1 ) 2 mL 带聚四氟乙婦涂层的螺旋盖子的瓶子（Interchim， Montlueon， France) 。
( 2 ) 2 mmol/L 肌醇水溶液（保存于 4°C ) 。
( 3 ) 甲醇-HCl 3 mol/L 试剂盒（Supelco，Bellefonte，PA ) ( 保存于 2~8°C )，打开一瓶，用甲醇稀释到 1 mol/L 甲醇-HCl 的浓度（见注释 1)。
( 4 ) 无水乙酸 98%，分析纯级试剂（Sigma Aldrich，Aldrich) ( 室温保存）。
( 5 ) 吡啶，99.8% 无水（Sigma Aldrich) ( 室温保存）。
( 6 ) 硅烷化试剂：六甲基二硅烷+三甲基氯硅烷+吡啶，3 : 1 : 9 ( Sylon HTP ) 试剂盒（Supelco) ( 保存于 2~8°C ; 见注释 1) 。
( 7 ) 环己烧 Rectapur ( VWR，FontenaysousBois，France) ( 室温保存）。
( 8 ) 配有 CP-SIL 5 CB 硅胶柱（25 m X 0.25 mm) 的气相色谱分析设备。
3. 糖苷释放后的蛋白质分析
1 ) 糖苷释放的化学处理方法
( 1 ) 配有聚四氟乙烯涂层螺帽的玻璃反应管（Pyrex 组培管）（Bibby Sterilin Stone, Staffs , England)。
( 2 ) 硼氢化钠溶液：在 100 mmol/L NaOH 溶液中，新鲜配制浓度为 40 mg/ml 的硼氢化钠溶液。
( 3 ) 98% 无水乙酸，分析纯级试剂（Sigma Aldrich，Aldrich) ( 室温保存）。
2) N - 或 O-糖苷酶酶促方法
( 1 ) 1% 十二烷基磺酸钠溶液（SDS）
( 2 ) 150 mmol/L 乙酸钠缓冲液，pH 5.7。
( 3 ) 内切糖苷酶 H : 来源于灰色链霉菌的内切糖苷酶 H，经大肠杆菌重组（Roche Applied Science) ( 保存在 2~8°C，冰冻会使酶失活) 。
( 4 ) 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，含 0.1% SDS。
( 5 ) 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，含 0. 5% Nonidet P40。
( 6 ) Nonidet P40 ( 现称为 IGEPAL；Sigma Aldrich ) 。
( 7 ) N-糖酰胺酶 F：来源于脑膜脓毒性黄杆菌的 N-糖酰胺酶 F。（Roche Applied Science) ( 保存于 -25~-15℃）。
( 8 ) 10 mmol/L HCl 溶液，pH 2.2。
( 9 ) C18 色谱柱：BondElntC 18 色谱柱（Varian，Palo Alto , CA ) (室温保存）。
( 10 ) 乙腈，纯度 99.5% 以上（Sigma Aldrich ) 。
( 11 ) 100 mmol/L 乙酸钠缓冲液，pH 5.5。
( 12 ) 来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶 A ( Sigma Aldrich ) 。
( 13 ) N-糖酰胺酶 A : 来源于甜杏仁油的 N-糖酰胺酶 A (Roche Applied Science)( 保存于一25~一15°C) 。
( 14 ) 去糖基化酶试剂盒（Prozyme， San Leandro, CA ) ( 保存于 4℃）。
2.3 被糖基化的蛋白在哪里
( 1 ) 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 8.0。
( 2 ) 胰蛋白酶：来源于牛胰腺的经 TPCK 处理的胰蛋白酶 （Sigma Aldrich, Fluka 产品）（ 保存于 -20°C ) 。
( 3 ) 胰凝乳蛋白酶： 来源于牛胰腺的经 TLCK 处理的胰凝乳蛋白酶（Sigma Aldrich) ( 保存于 -20°C ) 。
( 4 ) C18 色谱柱：Merck C18 Spherisorb ODS 2 色谱柱（5 μm，4.6 mm X 250 mm，VWR)。
( 5 ) 溶液 A : 90 : 10 水/乙腈含 0.1% 三氟乙酸（TFA ) 。
( 6 ) 溶液 B : 10 : 90 水/乙腈含 0.1% 三氟乙酸（TFA ) 。
2.4 怎样对全糖蛋白质组进行分析
1. 含高甘露糖 N - 糖苷糖蛋白的鉴定
( 1 ) TBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl。
( 2 ) Bradford 蛋白质定量测定试剂：Bio-Rad 蛋白质定量测定试剂（保存于 4°C ) 。
( 3 ) 0.20 μm 针头过滤器：Filtropur S 0.2 ( Sarstedt， Niimbrecht，Germany) 。
( 4 ) 刀豆蛋白 A-琼脂糖凝胶：Con A Sepharose 4B ( Amersham Biosciences) ( 保存于 4°C) 。
( 5 ) TBS：20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2 和 1 mmol/L MgCl2。
( 6 ) Poly-Prep 离子交换柱（Bio-Rad) 。
( 7 ) TTBS：20 mmol/L Tris- HCl 缓冲液，pH 7.4 , 含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2 和0.1% Tween-20。
( 8 ) 甲基-α-D- 吡喃甘露糖苷（Sigma Aldrich) ( 室温保存）。
2. O-GlcNAc 糖基化糖蛋白的鉴定
( 1 ) 神奇滤布（Calbiochem，Meudon，France) 。
( 2 ) WGA 缓冲液：20 mmol/L Tris - HCl，pH 7.8 , 含 150 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L 二硫苏糖（DTT ) 和蛋白酶抑制剂。
( 3 ) 鸡尾酒蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science) ( 保存于 4°C ) 。
( 4 ) Amicon Bioseparation YM-10 离心超滤管（Millipore， Saint Quentin en Yve lines, France)。
( 5 ) Nonidet P40 ( Sigma Aldrich) 。
( 6 ) N-糖酰胺酶 F : 来源于脑膜脓毒性黄杆菌的 N-糖酰胺酶 F ( Roche Applied Science) ( 保存于一25~一15°C)。
( 7 ) 麦胚凝集素-琼脂糖（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 8 ) N-乙酰葡糖胺（Sigma Aldrich) 。
4. 注释
( 1 ) 每个实验均使用新鲜的 3 mol/L 甲醇- HCl 和硅烷化试剂。
( 2 ) 要仔细识别蛋白质印迹，因为 WGA 既能识别 N-糖苷的 GlcNAc，也能识别 O-GlcNAc。
( 3 ) 用于在硝酸纤维素印迹膜上封闭结合位点的溶液应避免糖蛋白污染。所以我们建议在这一步骤中使用 Tween-20 来覆盖硝酸纤维素膜。
( 4 ) 特异性对照：
a. 建议印迹表 25-1 中的蛋白质到硝酸纤维素膜（建议的正对照），获得亲和检测的正对照。
b. 凝集素结合特异性应在 0.3 mol/L 抑制性糖（表 25-1 ) 浓度下进行亲和检测验证。
( 5 ) 可用的抗 O-糖苷抗体有：抗 AGP 抗体：LM2 [ 31，32] 、JIM 4、JIM 13、JIM 15 [32]、JIM 8 [33] 、JIM 14、JIM 15 和 JIM 16 [34]；抗伸展蛋白抗体：LM 1 [ 35 ] 、JIM 11、 JIM 12、JIM 20 [36] 和 JIM19 [ 37] 。
( 6 ) 免疫检测的 N-糖苷特异性对照：应验证血清对连接在被测蛋白的 N-糖苷的特异性，可在免疫检测前先对印迹进行温和的高碘酸盐氧化处理，温和高碘酸盐处理会氧化糖苷，并消除糖蛋白上抗苷抗体的识别位点。剩下的信号都是蛋白骨架抗体识别的结果 [ 38 ]。
a. 经明胶饱和处理后，将蛋白质印迹膜浸泡在 100 mmol/L 含 100 mmol/L 过碘酸钠的乙酸钠缓冲液（pH 4.5 ) 中，室温下黑暗处理 1 h，30 min 后更换一次浸泡液。
b. 将蛋白质印迹膜浸泡在含 50 mmol/L 硼氢化钠的 PBS 缓冲液中，室温下处理 30 min。
c. 用 TBS 漂洗蛋白质印迹膜，用含 1% 凝胶 的 TBS 浸泡蛋白质印迹膜 15 min，进行如 25. 3. 2 节 1. 1 ) 所述的免疫检测实验。
( 7 ) 岩藻糖或者木糖的特异性对照：有些蛋白质可被用作 N-糖苷免疫检测的正对照，源自蜂毒的磷脂酶含有 α-1-3岩藻糖残基，不含 β-1-2 木糖。源自玉米 的 PHA-L ( 植物血凝素 L ) 和重组抗生物素蛋白是既含 β-1-2 木糖，也含 α-1-3 岩藻糖的糖蛋白 [ 18，40 , 41 ] 。
( 8 ) 这里介绍的方法需要 1 mg 蛋白质，较少的蛋白质使用量也适用。
( 9 ) 用肌醇做内标。
( 10 ) 由于还原性氨化反应是一种激烈的处理，可能会发生一些蛋白质修饰。为此，有时候最好酶切去除 O-糖苷。
( 11 ) 总的来说，我们实验室不使用化学处理解离糖蛋白上的N - 糖苷。
( 12 ) Nonidet P40 的作用是结合游离的 SDS。
( 13 ) 需要 60~80 mg 的可溶油菜籽蛋白作为初始材料，制备足够跑一张 2D 凝胶的糖蛋白。
( 14 ) α-甲基甘露糖是刀豆蛋白 A 的配体，它将替换固定化凝集素上的糖蛋白。
( 15 ) 在洗脱亲和色谱柱时，我们观察到一个重要的解离物质刀豆蛋白 A。这一解离物质污染了糖蛋白制备物，迫使我们必须同时跑一张分析用 2D 凝胶，另一张 2D 凝胶只上样刀豆蛋白 A。染色后，我们选择只在分析用 2D 凝胶上出现的点，弃除同时在这两张 2D 凝胶上出现的点。
( 16 ) 150 ml 生长 6 天的拟南芥 cgl 突变体细胞培养物大约相当于 10 g 植物材料。
( 17 ) 细胞壁结合蛋白的去除是纯化的第一步，因为这些蛋白不含 O-位 N-乙酰葡糖胺。如果需要就应将这一纯化步骤包括在这个方法中。
( 18 ) 自由 O-位 N-乙酰葡糖胺是 WGA 的配体，它将替换固定凝集素上的糖蛋白。
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与其他真核细胞一样，植物细胞中，糖基化通常发生在分泌蛋白质上，虽然在细胞质蛋白和核蛋白上也发现一些糖基化反应。根据寡糖部分和蛋白质骨架之间的连接方式，可将糖基化分为两种类型：N -糖基化和 O-糖基化。植物中 N-糖基化研究最多。
1.1 N-糖基化
与其他真核细胞一样，在植物细胞中，N-糖基化只发生在进入分泌途径的蛋白质上。它从内质网中的寡聚糖前体 Glc3Man9GlcNAC2 共翻译转移到构成初生蛋白质 ( Asn-X-Ser/Thr，X 可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一种氨基酸）N--糖基化序列的特异天冬酰胺残基上开始，当新合成的蛋白质进入内质网腔后就发生 N 端序列糖基化反应（图 25-1B )。接着，当糖蛋白从内质网经高尔基体到达其最终目的地时，Glc3Man9GlcNAC2 前体沿着分泌途径进行进一步加工处理。如果糖基侧链能被内质网和高尔基体中的糖苷酶和糖基转移酶加工的话，Glc3Man9GlcNAc2 前体就会被成功转化为 Man9GlcNAc2 和 Man5GlcNAC2 范围内的髙甘露糖型 N-聚糖（图 25-1A)， 以及复杂形式的 N-聚糖。植物复杂形式 N-糖苷有一个挂在中心的近端氨基葡糖上的 α-1-3 岩藻糖；一个与中心少甘露糖连接的 β-1-2 木糖残基，和/或与它们的末端天线（称为 Lewisa ) 连接的 Gal/β-3 (Fucα-1-4 ) GlcNAc 寡聚糖末端序列，称为 Lewisa ( 图 25-1B ) [1] 。
1. 2 O-糖基化
在植物细胞中 O-糖基化可分为两种类型。即分泌蛋白糖基化或细胞质/核蛋白糖基化。蛋白质上不同位点的 O-连聚糖的性质不同。
1. 分泌蛋白质的 O-糖基化
对植物分泌蛋白的 O-糖基化的了解还很少。只有少数几篇文章报道了与植物糖蛋白上的一些丝氨酸或苏氨酸残基连接的 O-聚糖。一些糖蛋白，如细胞壁伸展蛋白和液泡中的甘薯贮藏蛋白（sporamin) 都被认为是一类含有一个单半乳糖 O-糖基化的丝氨酸残基的糖蛋白 [ 2，3] 。分析鉴定水稻被转运到液泡的谷蛋白也是为了证明哺乳动物黏蛋白型糖基化的存在，植物中这一类型 O-糖基化依然存在争议 [4] 。第二种类型的分泌蛋白 O-糖基化要求糖蛋白脯氨酸残基的羟基化，我们已发现植物中的富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGP)。HRGP 是植物中主要表面糖蛋白。这些定位于细胞壁或细胞质膜外表面的 HRGP，有三类蛋白质：伸展蛋白，阿拉伯半乳糖链蛋白（AGP ) 和茄科凝集素 ( 图 25-2)。伸展蛋白和茄科凝集素含有由丝氨酸- ( 羟脯氨酸 )4 组成的重复序列，这里 的丝氨酸可被 O-糖基化，而羟脯氨酸可被阿拉伯糖链取代 [5] 。这个阿拉伯糖化过程在髙尔基体中发生 [6]。AGP 家族是那些高糖基化的胞外蛋白和细胞质膜蛋白质。其蛋白质部分富含羟脯氨酸（Hyp) 、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸和甘氨酸，并含有 Ala-Hyp 重复序列。脯氨酰-4-羟化酶的催化作用可将内质网和/或高尔基体中脯氨酸转换成羟脯氨酸 [ 4，7 ] 。AGP 的 O-糖基化过程是一种添加了被 β-1-6 半乳糖支链取代 β-1-3 半乳糖数组的半寡聚糖支链的羟脯氨酸后的循序渐进的方式，β-1-6 半乳糖支链反过来由阿拉伯糖或者其他的低丰度的单糖依次形成分支（图 25 -2)。
2. O-GlcNAc 糖基化修饰
另外一种在哺乳动物中得到详细阐述的 O-糖基化形式是细胞质和细胞核蛋白的 O-GlcNAc 糖基化。这种在蛋白质上添加 O-GlcNAc 的修饰，在真核生物中非常普遍，发生在丝氨酸或苏氨酸的 β-连接上。尽管序列 Tyr-Ser-Pro-Tb- Ser- Pro -Sef ( 标有 _是发生糖基化的氨基酸）代表一类典型的 GlcNAc 连接位点 [9] ，但是对可被 OGlcNAc 糖基化的保守序列还不十分清楚。OGlcNAc 糖基化是一种高度动态过程，而且通常与 O-磷酸化修饰交互进行 [10] 。糖基转移酶的催化作用下，糖基被添加到蛋白质上，而在 OGlcNAc 糖苷酶的催化作用下，糖基被从蛋白质上移除许多细胞活动过程，如蛋白转运入细胞核、转录、细胞骨架附着在细胞膜上或蛋白合成等都参与了这个糖基化修饰，目前对它的确切作用还了解不多。
植物中有关 OGlcNAc 糖基化的报道还很少，与 OGlcNAc 转移酶相似的两个被命名为 SPINDLY 和 SEC 的酶已在拟南芥中克隆出来 [ 11，13] 。它们在离体条件下具有 OGlcNAc 转移酶活性，但还不清楚它们在植物体内的天然底物。此外，有报道将一些细胞核蛋白描述为携带末端为 GlcNAc 的 O-连聚糖的糖蛋白 [14，15 ] 。这些细胞核蛋白是否为 SPIN-DLY 和 SEC 的底物仍是个谜。
1.3 糖基化的异质性
真核细胞的成熟分泌糖蛋白 N-糖基化模式是内质网中的寡聚糖共翻译转运过程和其在内质网和高尔基体内加工的共同结果。多肽折叠因子会影响内质网内潜在糖基化位点 [16] 。结果导致蛋白质中的多个 N-糖基化位点中有些位点为无效糖基化位点，其他一些则未能完全糖基化 [17~19] 。
同时，多糖侧链的修饰加工与其是否接触到成熟的酶相关。虽然被包被在蛋白分子结构内部的寡糖仍然是未修饰的高甘露糖型 N-糖链，但位于蛋白质表面的糖苷将成熟转变为复杂形式的 N-糖苷 [17] 。这种现象也同样发生在 O-糖苷上。因此，要鉴定植物糖蛋白的糖基化，不仅需要鉴定糖-蛋白连接及附着在糖蛋白上的寡聚糖的结构，而且还要确定其在蛋白分子骨架上的潜在糖基化位点的分布/定位。
本章的目的是向植物蛋白质组学工作者介绍一些工具和方法，用于确定所鉴定的蛋白是否为糖蛋白，类别以及蛋白骨架上糖苷侧链的位置。本章的最后部分将论述植物糖蛋白质组学中的糖蛋白鉴定方法。
2. 材料
2.1 这个蛋白是糖蛋白吗
DIG 糖链检测试剂盒（Roche Applied Science， Mannheim，Germany) ( 保存于 2~8°C )
2.2 我的蛋白是怎样被糖基化的
1. 应用 Western 印记杂交检测糖苷
1 ) 凝集素亲和检测方法
( 1 ) TTBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl 和 0.1% Tween-20。
( 2 ) Lectin- biotin：GNA ( 雪花莲凝集素）-生物素（Vector Labs/Abcys，France) ( 保存于 2~8°C ) 和 WGA ( 麦胚凝集素)-生物素（Sigma Aldrich，Lyon，France) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 3 ) 链霉亲和素-过氧化物酶（Amersham Biosciences/GE，Healthcare，Uppsala，Sweden) ( 保存于 2~8℃）。
( 4 ) TBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl。
( 5 ) 4-氯-1- 萘酚（Bio- Rad，Hercules，CA ) ( 保存于 -20°C )。
( 6 ) 牛胰核糖核酸酶 B ( Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C) 。
( 7 ) 甲基比喃甘露糖苷（Sigma Aldrich ) ( 室温保存）。
( 8 ) 牛晶状体 α-A-晶体蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 -70°C ) 。
( 9 ) 卵清白蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8℃ ) 。
( 10 ) TTBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2；1 mmol/L MgCl2 和 0.1% Tween-20。
( 11 ) 刀豆球蛋白 A ( Sigma Aldrich) ( 保存于 5~8°C ) 。
( 12 ) 辣根过氧化物酶（HRP；Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 13 ) 大豆凝集素（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8℃）。
2 ) 特异抗体免疫检测方法
( 1 ) TBS 缓冲液：20 mmol/L Tris -HCl，pH 7.4，含 0. 5 mol/L NaCl。
( 2 ) 明胶（Bio- Rad) 。
( 3 ) 抗 HRP 免疫兔血清 （Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 4 ) 抗蜂毒抗体（蜂毒， Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 5 ) 鼠抗人 Lewisa 单克隆抗体（Calbiochem， Meudon， France) ( 保存于 -20℃）。
( 6 ) TTBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl 和 0.1% Tween -20。
( 7 ) 羊抗鼠免疫球蛋白辣根过氧化酶标记抗体（Sigma Aldrich) ( 保存于 -20°C ) 。
( 8 ) 羊抗兔免疫球蛋白辣根过氧化酶标记抗体（Bio- Rad ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 9 ) 来源于蜂毒的磷脂酶 A2 ( agm aAldrich ) ( 保存于 2~8°C) 。
( 10 ) 菜豆凝集素（PHA-L；Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 11 ) 玉米中表达的重组抗生物素蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
2. 糖苷的单糖组分分析
( 1 ) 2 mL 带聚四氟乙婦涂层的螺旋盖子的瓶子（Interchim， Montlueon， France) 。
( 2 ) 2 mmol/L 肌醇水溶液（保存于 4°C ) 。
( 3 ) 甲醇-HCl 3 mol/L 试剂盒（Supelco，Bellefonte，PA ) ( 保存于 2~8°C )，打开一瓶，用甲醇稀释到 1 mol/L 甲醇-HCl 的浓度（见注释 1)。
( 4 ) 无水乙酸 98%，分析纯级试剂（Sigma Aldrich，Aldrich) ( 室温保存）。
( 5 ) 吡啶，99.8% 无水（Sigma Aldrich) ( 室温保存）。
( 6 ) 硅烷化试剂：六甲基二硅烷+三甲基氯硅烷+吡啶，3 : 1 : 9 ( Sylon HTP ) 试剂盒（Supelco) ( 保存于 2~8°C ; 见注释 1) 。
( 7 ) 环己烧 Rectapur ( VWR，FontenaysousBois，France) ( 室温保存）。
( 8 ) 配有 CP-SIL 5 CB 硅胶柱（25 m X 0.25 mm) 的气相色谱分析设备。
3. 糖苷释放后的蛋白质分析
1 ) 糖苷释放的化学处理方法
( 1 ) 配有聚四氟乙烯涂层螺帽的玻璃反应管（Pyrex 组培管）（Bibby Sterilin Stone, Staffs , England)。
( 2 ) 硼氢化钠溶液：在 100 mmol/L NaOH 溶液中，新鲜配制浓度为 40 mg/ml 的硼氢化钠溶液。
( 3 ) 98% 无水乙酸，分析纯级试剂（Sigma Aldrich，Aldrich) ( 室温保存）。
2) N - 或 O-糖苷酶酶促方法
( 1 ) 1% 十二烷基磺酸钠溶液（SDS）
( 2 ) 150 mmol/L 乙酸钠缓冲液，pH 5.7。
( 3 ) 内切糖苷酶 H : 来源于灰色链霉菌的内切糖苷酶 H，经大肠杆菌重组（Roche Applied Science) ( 保存在 2~8°C，冰冻会使酶失活) 。
( 4 ) 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，含 0.1% SDS。
( 5 ) 0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，含 0. 5% Nonidet P40。
( 6 ) Nonidet P40 ( 现称为 IGEPAL；Sigma Aldrich ) 。
( 7 ) N-糖酰胺酶 F：来源于脑膜脓毒性黄杆菌的 N-糖酰胺酶 F。（Roche Applied Science) ( 保存于 -25~-15℃）。
( 8 ) 10 mmol/L HCl 溶液，pH 2.2。
( 9 ) C18 色谱柱：BondElntC 18 色谱柱（Varian，Palo Alto , CA ) (室温保存）。
( 10 ) 乙腈，纯度 99.5% 以上（Sigma Aldrich ) 。
( 11 ) 100 mmol/L 乙酸钠缓冲液，pH 5.5。
( 12 ) 来源于猪胃黏膜的胃蛋白酶 A ( Sigma Aldrich ) 。
( 13 ) N-糖酰胺酶 A : 来源于甜杏仁油的 N-糖酰胺酶 A (Roche Applied Science)( 保存于一25~一15°C) 。
( 14 ) 去糖基化酶试剂盒（Prozyme， San Leandro, CA ) ( 保存于 4℃）。
2.3 被糖基化的蛋白在哪里
( 1 ) 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 8.0。
( 2 ) 胰蛋白酶：来源于牛胰腺的经 TPCK 处理的胰蛋白酶 （Sigma Aldrich, Fluka 产品）（ 保存于 -20°C ) 。
( 3 ) 胰凝乳蛋白酶： 来源于牛胰腺的经 TLCK 处理的胰凝乳蛋白酶（Sigma Aldrich) ( 保存于 -20°C ) 。
( 4 ) C18 色谱柱：Merck C18 Spherisorb ODS 2 色谱柱（5 μm，4.6 mm X 250 mm，VWR)。
( 5 ) 溶液 A : 90 : 10 水/乙腈含 0.1% 三氟乙酸（TFA ) 。
( 6 ) 溶液 B : 10 : 90 水/乙腈含 0.1% 三氟乙酸（TFA ) 。
2.4 怎样对全糖蛋白质组进行分析
1. 含高甘露糖 N - 糖苷糖蛋白的鉴定
( 1 ) TBS 缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl。
( 2 ) Bradford 蛋白质定量测定试剂：Bio-Rad 蛋白质定量测定试剂（保存于 4°C ) 。
( 3 ) 0.20 μm 针头过滤器：Filtropur S 0.2 ( Sarstedt， Niimbrecht，Germany) 。
( 4 ) 刀豆蛋白 A-琼脂糖凝胶：Con A Sepharose 4B ( Amersham Biosciences) ( 保存于 4°C) 。
( 5 ) TBS：20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2 和 1 mmol/L MgCl2。
( 6 ) Poly-Prep 离子交换柱（Bio-Rad) 。
( 7 ) TTBS：20 mmol/L Tris- HCl 缓冲液，pH 7.4 , 含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2 和0.1% Tween-20。
( 8 ) 甲基-α-D- 吡喃甘露糖苷（Sigma Aldrich) ( 室温保存）。
2. O-GlcNAc 糖基化糖蛋白的鉴定
( 1 ) 神奇滤布（Calbiochem，Meudon，France) 。
( 2 ) WGA 缓冲液：20 mmol/L Tris - HCl，pH 7.8 , 含 150 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L 二硫苏糖（DTT ) 和蛋白酶抑制剂。
( 3 ) 鸡尾酒蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science) ( 保存于 4°C ) 。
( 4 ) Amicon Bioseparation YM-10 离心超滤管（Millipore， Saint Quentin en Yve lines, France)。
( 5 ) Nonidet P40 ( Sigma Aldrich) 。
( 6 ) N-糖酰胺酶 F : 来源于脑膜脓毒性黄杆菌的 N-糖酰胺酶 F ( Roche Applied Science) ( 保存于一25~一15°C)。
( 7 ) 麦胚凝集素-琼脂糖（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 8 ) N-乙酰葡糖胺（Sigma Aldrich) 。
4. 注释
( 1 ) 每个实验均使用新鲜的 3 mol/L 甲醇- HCl 和硅烷化试剂。
( 2 ) 要仔细识别蛋白质印迹，因为 WGA 既能识别 N-糖苷的 GlcNAc，也能识别 O-GlcNAc。
( 3 ) 用于在硝酸纤维素印迹膜上封闭结合位点的溶液应避免糖蛋白污染。所以我们建议在这一步骤中使用 Tween-20 来覆盖硝酸纤维素膜。
( 4 ) 特异性对照：
a. 建议印迹表 25-1 中的蛋白质到硝酸纤维素膜（建议的正对照），获得亲和检测的正对照。
b. 凝集素结合特异性应在 0.3 mol/L 抑制性糖（表 25-1 ) 浓度下进行亲和检测验证。
( 5 ) 可用的抗 O-糖苷抗体有：抗 AGP 抗体：LM2 [ 31，32] 、JIM 4、JIM 13、JIM 15 [32]、JIM 8 [33] 、JIM 14、JIM 15 和 JIM 16 [34]；抗伸展蛋白抗体：LM 1 [ 35 ] 、JIM 11、 JIM 12、JIM 20 [36] 和 JIM19 [ 37] 。
( 6 ) 免疫检测的 N-糖苷特异性对照：应验证血清对连接在被测蛋白的 N-糖苷的特异性，可在免疫检测前先对印迹进行温和的高碘酸盐氧化处理，温和高碘酸盐处理会氧化糖苷，并消除糖蛋白上抗苷抗体的识别位点。剩下的信号都是蛋白骨架抗体识别的结果 [ 38 ]。
a. 经明胶饱和处理后，将蛋白质印迹膜浸泡在 100 mmol/L 含 100 mmol/L 过碘酸钠的乙酸钠缓冲液（pH 4.5 ) 中，室温下黑暗处理 1 h，30 min 后更换一次浸泡液。
b. 将蛋白质印迹膜浸泡在含 50 mmol/L 硼氢化钠的 PBS 缓冲液中，室温下处理 30 min。
c. 用 TBS 漂洗蛋白质印迹膜，用含 1% 凝胶 的 TBS 浸泡蛋白质印迹膜 15 min，进行如 25. 3. 2 节 1. 1 ) 所述的免疫检测实验。
( 7 ) 岩藻糖或者木糖的特异性对照：有些蛋白质可被用作 N-糖苷免疫检测的正对照，源自蜂毒的磷脂酶含有 α-1-3岩藻糖残基，不含 β-1-2 木糖。源自玉米 的 PHA-L ( 植物血凝素 L ) 和重组抗生物素蛋白是既含 β-1-2 木糖，也含 α-1-3 岩藻糖的糖蛋白 [ 18，40 , 41 ] 。
( 8 ) 这里介绍的方法需要 1 mg 蛋白质，较少的蛋白质使用量也适用。
( 9 ) 用肌醇做内标。
( 10 ) 由于还原性氨化反应是一种激烈的处理，可能会发生一些蛋白质修饰。为此，有时候最好酶切去除 O-糖苷。
( 11 ) 总的来说，我们实验室不使用化学处理解离糖蛋白上的N - 糖苷。
( 12 ) Nonidet P40 的作用是结合游离的 SDS。
( 13 ) 需要 60~80 mg 的可溶油菜籽蛋白作为初始材料，制备足够跑一张 2D 凝胶的糖蛋白。
( 14 ) α-甲基甘露糖是刀豆蛋白 A 的配体，它将替换固定化凝集素上的糖蛋白。
( 15 ) 在洗脱亲和色谱柱时，我们观察到一个重要的解离物质刀豆蛋白 A。这一解离物质污染了糖蛋白制备物，迫使我们必须同时跑一张分析用 2D 凝胶，另一张 2D 凝胶只上样刀豆蛋白 A。染色后，我们选择只在分析用 2D 凝胶上出现的点，弃除同时在这两张 2D 凝胶上出现的点。
( 16 ) 150 ml 生长 6 天的拟南芥 cgl 突变体细胞培养物大约相当于 10 g 植物材料。
( 17 ) 细胞壁结合蛋白的去除是纯化的第一步，因为这些蛋白不含 O-位 N-乙酰葡糖胺。如果需要就应将这一纯化步骤包括在这个方法中。
( 18 ) 自由 O-位 N-乙酰葡糖胺是 WGA 的配体，它将替换固定凝集素上的糖蛋白。
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