材料与仪器
尿素裂解溶液 IPG 干胶条水化液 IPG 胶条平衡液 SDS 凝胶缓冲液 电极缓冲液储液 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺溶液 过硫酸铵溶液 琼脂糖溶液
等电聚焦仪 IPGphor 多重垂直 SDS 电泳仪
等电聚焦仪 IPGphor 多重垂直 SDS 电泳仪
步骤
3.1 第一向：在 IPG 胶条中进行等电聚焦（ IPG-IEF)
采用 IPG ( IPG-Dalt ) 的双向电泳技术的第一向，等电聚焦（IEF) 是采用独立的，3 mm 宽的，附着在 GelBond PAG 支持膜上的 IPG 胶条进行的。目前已有 7cm、11cm、18cm 和（或）24 cm 长的几乎所有需要的 pH 范围的预制 Immobiline 干胶条。例如，宽 pH 范围的 IPG 3~10 和 IPG 3~11，中等 pH 范围的 IPG 4~7 或 IPG 6~9 , 窄 pH 范围的 IPG 4~5 或 IPG 4.5~5.5 ( 如 GE Healthcare，Bio- Rad，Sigma- Aldrich，Serva) 。或者也可使用实验室自制 IPG 干胶条。关于 IPG 灌制的细节，有兴趣的读者可以参考之前发表的方法 [21] 。
在进行 IEF 之前，需要水化 IPG 干胶条，然后再将胶条置于水平等电聚焦仪的冷却盘上 [13，22] 。最近，一种 叫做 IPGphor 的整体系统的使用简化并加速了 IPCMEF。这种仪器的特点有：在持胶槽中水化单独的 IPG 干胶条或在水化同时上样，可以选择杯上样，使用高电压（8000V ) 进行后续 IEF，在 IPG 干胶条放入陶瓷持胶槽后无需再对其进行操作。
当使用 pH 大于 9 的 IPG 胶条时，DTT 的消耗会导致碱性端的水平漂移。为消除漂移，在胶条的水化液中，可用二硫代羟乙基（HED) (DeStreak，GE Healthcare ) 代替 DTT 等还原剂来保持半胱氨酸中二硫键的稳定。除了能去除漂移外，使用 HED 使点更清晰并提髙重复性 [23] 。而且，使 用 IPGphor，可使如核糖体和核蛋白等等电点大于 10 的极端碱性蛋白的等电聚焦得到大大的简化。
1. IPG 胶条的水化和上样
在进行 IEF 之前，IPG 干胶条必须在水化盒或水化盘中水化至其原始厚度 0.5 mm。IPG 干胶条可用溶解有样品的水化液进行水化（水化上样 ) [24] 或用不含样品的水化液进行水化，然后再用杯上样的方法上样。虽然水化上样更方便，但在样品含有高分子质量( < 100 kDa) ，极端碱性和（或）极端疏水的蛋白质时不推荐使用这种方法。这是因为这些蛋白质不易进入胶内。其原因可能是蛋白质和水化盘壁之间的疏水互作或凝胶基质孔径的限制作用。如果样品体积显著地超出 IPG 胶条水化后预计达到的体积，后一种现象就特别明显。高分子质量蛋白质更可能留在多出的水化液中而不是进入 IEF 胶中。交叉污染也是一个问题，因此水化盘在不同次实验之间必须彻底清洗。总之，水化上样不如杯上样可靠，特别是在定量实验中。
在杯上样中，IPG 干胶条仍旧用水化液水化。IPG 胶条水化后，将溶解在裂解缓冲液中的样品（20~100 μl ) 加 入在 IPG 胶条表面上的一次性塑料或硅胶杯中（见注释 3)。将样品加在 pH 极端位置时效果最好，也就是靠近阴极或阳极。大多数情况下在阳极附近上样比在阴极附近上样更好。当使用碱性 pH 梯度，如 IPG 6~12 或 9~12，所有样品都必须从阳极上样 [15~17] 。
单根 IPG 胶条的蛋白质上样量由几个因素决定。按照经验：分离距离越长（也就是胶条越长），pH 梯度范围越窄，蛋白质检测方法越不灵敏，则所需蛋白质越多。20 cm X 20 cm 的分析用（银染）双向电泳凝胶的推荐上样量为 50~100 μg，微量制备凝胶的推荐上样量多至 1 mg ( 或更多）。当使用非常窄的 pH 范围的 IPG 胶条时，我们强烈建议仅使用预分离后的样品 [ 25 ] 。
1 ) 用水化盘水化 IPG 干胶条
( 1 ) 如果在水化的同时上样 [24]，则直接将细胞裂解产物或组织样品（5~10 mg 蛋白质/ml ) 溶解至适量的 IPG 干胶条水化液中。水化 180 mm 长、3 mm 宽的胶条时，可吸取 350 μl 上述溶液置于 IPG 干胶条水化盘中的凹槽中（图 13-2)。如 IPG 胶条更长或更短，水化液体积需要进行相应换算（如 240 mm 长的 IPG 干胶条用 450 μl) 。
( 2 ) 从 IPG 干胶条表面撕去保护膜，将 IPG 胶条胶面朝下放入凹槽中，同时避免产生气泡。然后用 IPG 干胶条覆盖油覆盖 IPG 胶条（避免水化时胶条变干）。覆盖前胶条应能够活动且没有粘在水化盘上。覆盖后在约 20°C 条件下过夜水化 IPG 胶条。温度过高（ > 37°C ) 有氨基甲酰化的危险，而温度过低（< 15°C ) 会导致尿素在 IPG 胶中结晶。
( 3 ) 如果使用杯上样，则将 IPG 干胶条用没有样品的水化液在水化盘中仍旧按上述第二步的方法过夜水化。
2 ) 用 IPGphor 持胶槽水化胶条并同时上样
( 1 ) 用样品溶解缓冲液（也就是尿素/硫脲裂解缓冲液）溶解蛋白质并用 IPG 干胶条水化缓冲液稀释提取液。
( 2 ) 将所需数量的 IPGphor 持胶槽（图 13-2) 置于 IPGphor 的冷却盘/电极区域。
( 3 ) 吸取 350 μl 溶有样品的水化液（使用 180 mm 长 的 IPG 胶条时）放入持胶槽底部。
( 4 ) 由 IPG 胶条上去除保护膜，然后缓慢地将 IPG 胶条（胶面朝下）放入水化液中。避免产生气泡。胶条应仍然能够活动且没有粘在水化盘上。用 1~2 ml IPG 干胶条覆盖油覆盖 IPG 胶条然后盖上塑料盖。按压在盖子下的支撑块以确保 IPG 胶条在水化时与电极保持良好接触。水化时加低电压（30~50 V ) 以使高分子质量蛋白质更好地进入胶内 [15，28] 。
2. 在平板仪器上进行 IPG-IEF ( Multiphor ll Unit)
满足下列条件时，水化后的 IPG 胶条可以直接放在 IEF 仪器的冷却板上：① 如果运行时间不超过 12 h ( 经常发生在宽的或中等 pH 范 围 IPG，如 IPG 3~10 或 4~7 ) 。② 如果 pH 梯度不超 过 pH 10. 0。③ 如果只用杯上样的方法加很小体积的样品 ( 20 μl ) [ 3，22 ]。使用 Immobiline 干胶条试剂盒中的上样杯更方便进行大体积的样品上样( 直至 100 μl )。当用干胶条试剂盒进行 IEF 时，IPG 胶条可以用硅树脂油或干胶条覆盖油覆盖。当样品为极端碱性（pH > 10.0 ) 蛋白质或用窄 pH 梯度（ pH 范围< 1 单位）进行微量制备电泳时必须用覆盖油等覆盖；而当 pH 范围较宽且 pH 梯度不超过 pH 10.0 ( 如 IPG 4~7 或 3~10 ) 时，使用干胶条试剂盒时可不加覆盖油。
( 1 ) 将冷却盘放入 Multiphor ll 电泳仪中。吸取 3~4 ml 煤油或 IPG 干胶条覆盖油加在冷却盘上，然后将 Immobiline 干胶条盘放在冷却盘上（图 13-2)。在胶条盘和冷却盘之间避免产生气泡。
( 2 ) 将胶条盘上的电极连至 Multiphor II 电泳仪上。
( 3 ) 将 10 ml 左右的 IPG 干胶条覆盖油或硅树脂油注入胶条盘中，将波纹状的 Immobiline 胶条标尺放在胶条盘中的覆盖油的顶端。
( 4 ) IPG 胶条水化后（见 13. 3.1 节 1.1)，用干净的镊子从水化盘中取出水化好的 IPG 胶条。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止 IEF 过程中尿素在胶表面结晶。转移水化后的 IPG 胶条（胶面朝上且酸性端对准阳极）放入槽中并靠近标尺。排列 IPG 胶条并保证对着阳极的胶条边缘排列整齐。
( 5 ) 切取两条 IEF 电极条（GE Healthcare ) 或由厚 2 mm 的滤纸（如 MN440，Macherey Nagel，Germany ) 制成的滤纸条，其长度为所有 IPG 胶条在胶条盘中排列的相应宽度。用去离子水浸泡电极条，再用滤纸吸走多余液体，然后将湿润的 IEF 电极条放在排列整齐的胶条的阴极和阳极附近。
( 6 ) 将电极放在 IEF 电极条上并轻轻向下按压电极。
( 7 ) 如果样品已经在水化时进入胶条，则用约 80 ml 干胶条覆盖油覆盖胶条，然后转至第 12 步。如果用杯上样方法，则继续第 8 步。
( 8 ) 将上样杯放入上样杯槽中，但要避免接触胶条表面。而且，确保上样杯与阳极 ( 或阴极，如果使用阴极上样）之间有几毫米的距离。
( 9 ) 将上样杯移动至合适位置，每个胶条上一个上样杯，然后轻轻向下压上样杯。上样杯要和胶条紧密接触但不能损坏胶条表面。
( 10 ) 放好上样杯之后，向胶条盘中注入约 80 ml 的干胶条覆盖油以完全覆盖 IPG 胶条。如果覆盖油漏入上样杯，吸出覆盖油，重新调整上样杯，再次检查是否漏液。在每个上样杯中加入几滴干胶条覆盖油。如果使用 pH 为 3~ 10 的宽 pH 梯度进行 IEF，加覆盖油这一步可以省略。
( 11 ) 吸取样品并加人覆盖油下的上样杯底部。再次检查是否漏液。
( 12 ) 关闭等电聚焦箱的盖子，根据表 13-1中的参数开始电泳。为使样品更好地进入胶内，最初几小时的电压应被限制在 150V 、300V、600V。然后用最大电压 3500V 电泳至稳态（见注释 4) 。电流限制在 0.05 mA/IPG 胶条。最佳聚焦温度是 20°C [ 26] 。
( 13 ) 当 IEF 结束后，从胶条盘中取出电极、上样杯槽和 IEF 电极条。用干净的镊子从胶条盘中取出 IPG 胶条。如果 IPG 胶条不被立刻用来进行第二向电泳和（或）用来进一步研究，可将它们夹在两层塑料膜之间贮存在 -70°C，可贮存数月。
3. 使用 IPGphor 电泳仪进行 IPG-IEF
使用一种叫做 IPGphor ( GE Healthcare，最近 Bio-Rad 也开发出一套类似的系统）的整体系统可使双向电泳中的 IPG-IEF 简化 IPGphor 包括一个可精确控温（在 19.5~20.5°C ) 的 Peltier 元件和一个可编程的电源。这个仪器的核心部分是不同长度的（7cm、11cm、13cm、18cm 或 24cm) 氧化铝陶瓷制的细槽，被称为持胶槽。IPG 胶条可在持胶槽中水化并同时上样，然后进行 IEF。当胶条被放入持胶槽后，后续步骤无需对胶条进行进一步操作（图 13-2)。IPGphor 是可编程的，而且最多可以存储 10 组不同程序。该仪器支持延迟启动，这使得使用者可以在下午在持胶槽中用含有样品的水化液水化胶条，然后晚上 IEF 自动启动并在第二天早上结束。
当在碱性 pH 范 围内（＞ pH 10.0 ) 进行蛋白质分离时，用杯上样的方法单独对不同的水化好的 IPG 胶条上样比用水化上样的方法上样得到的分离效果好得多。可以使用特殊杯上样（“ 通用” ）IPGphor 持胶槽，或复合式杯上样持胶槽（“ 复合式” ）进行样品的杯上样（图 13-2)。杯上样最多允许上 100 μl 样品（见注释 3) 。持胶槽平台能够调节温度并能将持胶槽与电源连接。除了操作简单外，IPGphor 的另一个优势是聚焦时间短。这是因为用 IPGphor 能在很髙的电压下（最高 8000 V ) 进行 IEF。
使用 IPGphor 进行 IEF 的典型工作条件见表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那样 ，为了使高分子质量的蛋白质更好地进入聚丙烯酰胺胶内，水化时应在胶条两端加低电压（30~50 V ) ，否则将给水化上样造成困难[ 15，28] 。然后电压逐步升高至 8000 V。如果 IPG 胶条的分离长度 < 11 cm，电压应限制在 5000 V 内。为在分离含盐量高的样品或使用窄 pH 间隔分离样品时得到最佳效果，在电压升髙至 8000 V 之前可在电极和 IPG 胶条之间垫上湿润的滤纸片（尺寸：4mm X 4mm) ( 见注释 4 ) 。当 IEF 结束后，按13. 3.1 节 2. 第 13 步中的方法贮存 IPG 胶条。
1 ) 水化上样 IEF
( 1 ) 将所需数量的持胶槽放在冷却盘或 IPGphor 的电极区（图 13-2 ) 上。吸取适量 （如 180 mm 长 IPG 胶条吸取 350 μl）的含有样品的 IPG 干胶条水化液注入持胶槽中，将 IPG 胶条胶面朝下放入水化液中，然后用 IPG 干胶条覆盖油覆盖。具体方法见 13. 3.1 节 1. 2) 。
( 2 ) 设置 IPGphor ( 所需的水化时间、伏小时、电压梯度）。
( 3 ) IPG 胶条水化后（至少需要 6 h，通常过夜），按表 13-2 所列参数开始 IEF。
( 4 ) IEF 完成后，将那些不立刻进行第二向电泳的 IPG 胶条夹在两层塑料膜之间贮存于 -70°C。
2 ) 杯上样 IEF
( 1 ) 在水化盘中用不含样品的水化液水化 IPG 干胶条。IPG 胶条水化后，用干净的镊子将水化好的 IPG 胶条从水化盘或水化盒中取出。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止 IEF 过程中尿素在胶表面结晶。见 13. 3.1 节 2. 。
( 2 ) 将所需数量的杯上样持胶槽放在冷却盘或 IPGphor 的电极区上，确保持胶槽的尖端（阳极）与电极区的阳极区相连。可以使用复合式持胶槽代替独立持胶槽。
( 3 ) 将水化好的 IPG 胶条放入杯上样持胶槽（或复合式持胶槽）中，胶面朝上且胶条尖端（酸性端）对准阳极。确保 IPG 胶条的阴极距离槽的末端约 1.5 cm 且通过电极丝与电极连通。
( 4 ) 用去离子水润湿两张电极滤纸垫片（尺寸：4 mmX10 mm) ，用滤纸吸掉过多的去离子水，然后将润湿的电极滤纸垫片放在阳极和阴极电极与 IPG 胶条之间 IPG 胶条的表面上。如果必要（如当样品含盐量高），数小时后可以更换新的滤纸垫片。
( 5 ) 将活动电极放在电极滤纸垫片上。夹紧电极使其紧压电极滤纸垫片。
( 6 ) 将可移动的上样杯放在阳极或阴极附近，然后轻轻将上样杯压在 IPG 胶条表面上。上样杯应与 IPG 胶条紧密接触但不能损伤胶条表面。
( 7 ) 为确保上样杯不漏液，向杯中加入 100 μl IPG 覆盖油。如发现漏液，除去覆盖油并用绵纸吸净覆盖油，然后重新放置上样杯。再次检查是否漏液。上样前吸出覆盖油。
( 8 ) 每根胶条用 2~4 ml IPG 胶条覆盖油覆盖（建议不要使用硅树脂油或煤油替代 IPG 胶条覆盖油）。万一覆盖油漏入上样杯，重新放置上样杯并用绵纸吸净杯中的覆盖油。再次检查是否漏液，然后吸取样品（20~100 μl ) 加入上样杯。
( 9 ) 设置仪器（所需伏小时、电压梯度、温度等）并按表 13-2 和表 13-3 中推荐的参数进行 IEF。省去表 13-2中为水化上样推荐的低电压水化步骤。
( 10 ) IEF 完成后，继续进行平衡或第二向 IEF ( SDS-PAGE ) ( 见 13.3.3 节），或将 IPG 胶条夹在两层塑料膜之间贮存于 -70°C，可贮存数月。
3.2 IPG 胶条平衡
在进行第二向分离（SDS-PAGE ) 之前，平衡 IPG 胶条使胶条中分离的蛋白质与 SDS 充分作用十分重要。由于与载体两性电解质凝胶相比，聚焦后的蛋白质与 IPG 胶条的结合更加紧密，因此需要相对长的平衡时间（10~15 min) 以及尿素和甘油来改善蛋白质在第一向和第二向之间的转移效果。其中尿素和甘油可以减轻电渗作用的影响。目前最常用的步骤是将 IPG 胶条在一种最初由 Gorg 等 [13] 提出的缓冲液 [ 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.8) 、2% (m/V ) SDS、1% ( m/V）DTT、6 mol/L 尿素、30% (m/V) 甘油；表 13-4 中平衡 10~15 min。然后再将胶条在把上述缓冲液中的 DTT 换成 4% ( m/V ) 碘乙酰胺后形成的缓冲液中进一步平衡 10~15 min。后面的步骤是用来烷基化游离的 DTT，否则 DTT 会在第二向 SDS-PAGE 胶中迁移，从而导致点拖尾现象。该现象在银染之后就会被观察到。更重要的是，碘乙酰胺会烷基化巯基并阻止它们的氧化还原作用。我们强烈推荐使用这种还原/烷基化两步程序，这是因为它能够相当程度上简化后续质谱鉴定的样品制备工作（胶内消化蛋白质）。平衡后，IPG 胶条被放在第二向水平或垂直 SDS-PAGE 胶的表面。
( 1 ) 溶解 100 mg DTT ( Sigma-Aldrich ) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 I 。
a. 为每根胶条准备 10 ml。
b. 将每根聚焦后的胶条放入一个试管（250 mm 长 ，内径 20mm) 中，在每个试管中加入 10 ml 平衡液 I 。
c. 试管用 Pamfilm 密封后在摇床上摇动 15 min，然后倒出平衡液。也可使用较短的平衡时间（10 min) ，不过这样做的风险是在样品进入 SDS-PAGE 胶时一些蛋白质可能不会从 IPG 胶条中出来。如果这样，应当在把 IPG 胶条从 SDS 胶上取下后将 IPG 胶条染色，以检查是否所有的蛋白质离幵了 IPG 胶条。
( 2 ) 溶解 0.4 g 碘乙酰胺（Sigma- Aldrich) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 Ⅱ。
a. 为每根 IPG 胶条准备 10 ml。
b. 向每根胶条加入 10 ml 平衡液Ⅱ和 50 μl 作为 SDS-PAGE 指示剂的溴酚蓝（Serva) 溶液，再次轻轻摇动平衡 15 min。
( 3 ) 倒出平衡液Ⅱ，进行 SDS-PAGE ( 见 13.3.3 节）。如果用水平电泳槽（ 如 Muhiphor Ⅱ ) 进行 SDS-PAGE ，用去离子水短暂地冲洗 IPG 胶条，然后将胶条放在一张滤纸的一边，等待几分钟以吸净多余的平衡液。如果用垂直电泳槽（如 EttanDalt ) 进行 SDS-PAGE，用电极缓冲液短暂地冲洗 IPG 胶条。
3.3 第二向：多重垂直 SDS-PAGE
SDS-PAGE 可以在水平或垂直系统上进行 [29] 。水平设备适用于预制胶（ExcelGel SDS；Amersham Biosciences/ GE Healthcare) 。而垂直系统则应用于多块胶平行进行的电泳中，尤其是大规模的蛋白质组分析中。这种分析通常需要同时进行数批第二向 SDS-PAGE 电泳以达到更高的通量和最好的重复性 [31] 。
1. 灌制 SDS 胶
( 1 ) 灌胶胶板（200 mm X 250 mm) 由两块书本形状的 3 mm 厚的玻璃板组成。两块玻璃板用一根铰链条连接，玻璃板之间有两条 1 mm 厚的边条。将 14 块胶板垂直堆入 Ettan Dah II 的灌胶模具中。堆叠时铰链条朝右，胶板之间用塑料分隔片（如 0.05 mm 厚聚酯片）分隔。
( 2 ) 将灌胶模具的前板放好，旋上螺帽（用手拧紧）（图 13-2)。
( 3 ) 用环架将一个漏斗支撑在灌胶模具顶端上方约 30 cm 处，用一根聚乙烯管（内径 5 mm ) 与之连接。管的另一头与灌胶模具一边的侧室上的金属接口相连。
( 4 ) 向侧室中灌入 100 ml 指示剂。
( 5 ) 在即将灌胶之前，在凝胶溶液中加入 TEMED 和过硫酸氨溶液（表 13-5)。灌胶时，将凝胶溶液（830 ml) 注入漏斗。管中避免产生气泡。不要用丙烯酰胺溶液将胶板灌满。这是由于用热琼脂糖将 IPG 胶条固定在 SDS 胶顶端时需要一定的空间（约 10 mm)。
( 6 ) 当溶液注入之后，将管从侧室接口上取下。此时侧室中指示剂的水平面会下降。
( 7 ) 小心地向每块胶的顶端加入约 1 ml 覆盖液以使胶面平整光滑。
( 8 ) 让凝胶在约 20°C 聚合至少 3 h，为获得更好的重复性，最好过夜聚合。
( 9 ) 胶聚合后，将灌胶模具的前板取下，小心地从模具中取出胶板。可用刀片将胶板分开。将胶板之间的分隔片取下。
( 10 ) 用水清洗胶板以除去胶板外表面的丙烯酰胺，然后将多余液体从胶上端排出。由于电泳一次只能用掉 12 块胶板，应丢弃不理想的胶板，尤其是厚度不均匀的胶板。通常是外侧的胶板。
( 11 ) 如果聚合好的凝胶不被立即使用，可将它们用塑料包好贮存在冰箱中（4°C )。最长可贮存 2 天。
2. 使用 Ettan Dalt II 垂直电泳槽进行多重 SDS-PAGE
( 1 ) 向 Ettan Dalt II 电泳槽下槽中加入 1875 ml 电极缓冲液储液和 5625 ml 去离子水。混合并打开冷却器（25°C)。
( 2 ) 将 DALT 胶板（内有 SDS 凝胶）垂直放置在胶板架上以便放上 IPG 胶条。
( 3 ) 用电极缓冲液（用水 1 : 1 稀释）短暂冲洗平衡好的 IPG 胶 条，将胶条放在 DALT 胶板顶端。
a. 用薄刮刀或尺子推 IPG 胶条背后支持膜，使胶条进入两层玻璃板之间的空隙中。
b. 加入 2 ml 热（75°C ) 琼脂糖溶液，继续将胶条向下推向 SDS 胶表面直到两者紧密接触。IPG 胶条和 SDS 胶表面之间避免产生气泡。
c. 如需在电泳同时加入分子质量标准蛋白质，可用 5 μl 溶有 SDS 标准蛋白质的电极缓冲液浸泡一张滤纸片（2~4 mm2 ) 。弄干滤纸片后将其放在 IPG 胶条的左侧或右侧。
d. 干燥后的溶有分子质量标准蛋白质的滤纸片可放在微量离心管中贮存于 -70°C。
( 4 ) 在将胶板放入电泳设备（见第 5 步）之前让琼脂糖凝固至少 5 min。对剩余 IPG 胶条重复上述步骤。虽然将胶条埋入琼脂糖并不是必须的，但这样做能保证 IPG 胶条和 SDS 凝胶顶端结合更紧密。
( 5 ) 将胶板浸入电极缓冲液使其外侧湿润以便放入电泳槽时更容易。将胶板插入电泳槽中。如有必要，在电泳槽中空着的狭槽中放入空的胶板。将上槽穿过胶板放好，并在其中加入 2.5L 电极缓冲液（1250 ml 储液 + 1250 ml 去离子水) 。
( 6 ) 盖上电泳槽的安全盖，并开始 SDS-PAGE。开始时以每块胶 5 mA ( 设置最高 100V ) 跑大约 2 h。然后以每块胶 15 mA ( 设置最高 200V ) 过夜跑大约 16 h，或更高的电流以便跑得更快（每块胶 30 mA 大约 8 h)。
( 7 ) 当溴酚蓝踪迹迁移出凝胶下端后终止电泳。
( 8 ) 电泳结束后，小心地用塑料刮刀打开胶板。用刮刀将琼脂糖从聚丙烯酰胺凝胶上去除。小心地从玻璃板上剥下凝胶，拎着它的下缘将其放入装有固定液或染色液的盒子里。
采用 IPG ( IPG-Dalt ) 的双向电泳技术的第一向，等电聚焦（IEF) 是采用独立的，3 mm 宽的，附着在 GelBond PAG 支持膜上的 IPG 胶条进行的。目前已有 7cm、11cm、18cm 和（或）24 cm 长的几乎所有需要的 pH 范围的预制 Immobiline 干胶条。例如，宽 pH 范围的 IPG 3~10 和 IPG 3~11，中等 pH 范围的 IPG 4~7 或 IPG 6~9 , 窄 pH 范围的 IPG 4~5 或 IPG 4.5~5.5 ( 如 GE Healthcare，Bio- Rad，Sigma- Aldrich，Serva) 。或者也可使用实验室自制 IPG 干胶条。关于 IPG 灌制的细节，有兴趣的读者可以参考之前发表的方法 [21] 。
在进行 IEF 之前，需要水化 IPG 干胶条，然后再将胶条置于水平等电聚焦仪的冷却盘上 [13，22] 。最近，一种 叫做 IPGphor 的整体系统的使用简化并加速了 IPCMEF。这种仪器的特点有：在持胶槽中水化单独的 IPG 干胶条或在水化同时上样，可以选择杯上样，使用高电压（8000V ) 进行后续 IEF，在 IPG 干胶条放入陶瓷持胶槽后无需再对其进行操作。
当使用 pH 大于 9 的 IPG 胶条时，DTT 的消耗会导致碱性端的水平漂移。为消除漂移，在胶条的水化液中，可用二硫代羟乙基（HED) (DeStreak，GE Healthcare ) 代替 DTT 等还原剂来保持半胱氨酸中二硫键的稳定。除了能去除漂移外，使用 HED 使点更清晰并提髙重复性 [23] 。而且，使 用 IPGphor，可使如核糖体和核蛋白等等电点大于 10 的极端碱性蛋白的等电聚焦得到大大的简化。
1. IPG 胶条的水化和上样
在进行 IEF 之前，IPG 干胶条必须在水化盒或水化盘中水化至其原始厚度 0.5 mm。IPG 干胶条可用溶解有样品的水化液进行水化（水化上样 ) [24] 或用不含样品的水化液进行水化，然后再用杯上样的方法上样。虽然水化上样更方便，但在样品含有高分子质量( < 100 kDa) ，极端碱性和（或）极端疏水的蛋白质时不推荐使用这种方法。这是因为这些蛋白质不易进入胶内。其原因可能是蛋白质和水化盘壁之间的疏水互作或凝胶基质孔径的限制作用。如果样品体积显著地超出 IPG 胶条水化后预计达到的体积，后一种现象就特别明显。高分子质量蛋白质更可能留在多出的水化液中而不是进入 IEF 胶中。交叉污染也是一个问题，因此水化盘在不同次实验之间必须彻底清洗。总之，水化上样不如杯上样可靠，特别是在定量实验中。
在杯上样中，IPG 干胶条仍旧用水化液水化。IPG 胶条水化后，将溶解在裂解缓冲液中的样品（20~100 μl ) 加 入在 IPG 胶条表面上的一次性塑料或硅胶杯中（见注释 3)。将样品加在 pH 极端位置时效果最好，也就是靠近阴极或阳极。大多数情况下在阳极附近上样比在阴极附近上样更好。当使用碱性 pH 梯度，如 IPG 6~12 或 9~12，所有样品都必须从阳极上样 [15~17] 。
单根 IPG 胶条的蛋白质上样量由几个因素决定。按照经验：分离距离越长（也就是胶条越长），pH 梯度范围越窄，蛋白质检测方法越不灵敏，则所需蛋白质越多。20 cm X 20 cm 的分析用（银染）双向电泳凝胶的推荐上样量为 50~100 μg，微量制备凝胶的推荐上样量多至 1 mg ( 或更多）。当使用非常窄的 pH 范围的 IPG 胶条时，我们强烈建议仅使用预分离后的样品 [ 25 ] 。
1 ) 用水化盘水化 IPG 干胶条
( 1 ) 如果在水化的同时上样 [24]，则直接将细胞裂解产物或组织样品（5~10 mg 蛋白质/ml ) 溶解至适量的 IPG 干胶条水化液中。水化 180 mm 长、3 mm 宽的胶条时，可吸取 350 μl 上述溶液置于 IPG 干胶条水化盘中的凹槽中（图 13-2)。如 IPG 胶条更长或更短，水化液体积需要进行相应换算（如 240 mm 长的 IPG 干胶条用 450 μl) 。
( 2 ) 从 IPG 干胶条表面撕去保护膜，将 IPG 胶条胶面朝下放入凹槽中，同时避免产生气泡。然后用 IPG 干胶条覆盖油覆盖 IPG 胶条（避免水化时胶条变干）。覆盖前胶条应能够活动且没有粘在水化盘上。覆盖后在约 20°C 条件下过夜水化 IPG 胶条。温度过高（ > 37°C ) 有氨基甲酰化的危险，而温度过低（< 15°C ) 会导致尿素在 IPG 胶中结晶。
( 3 ) 如果使用杯上样，则将 IPG 干胶条用没有样品的水化液在水化盘中仍旧按上述第二步的方法过夜水化。
2 ) 用 IPGphor 持胶槽水化胶条并同时上样
( 1 ) 用样品溶解缓冲液（也就是尿素/硫脲裂解缓冲液）溶解蛋白质并用 IPG 干胶条水化缓冲液稀释提取液。
( 2 ) 将所需数量的 IPGphor 持胶槽（图 13-2) 置于 IPGphor 的冷却盘/电极区域。
( 3 ) 吸取 350 μl 溶有样品的水化液（使用 180 mm 长 的 IPG 胶条时）放入持胶槽底部。
( 4 ) 由 IPG 胶条上去除保护膜，然后缓慢地将 IPG 胶条（胶面朝下）放入水化液中。避免产生气泡。胶条应仍然能够活动且没有粘在水化盘上。用 1~2 ml IPG 干胶条覆盖油覆盖 IPG 胶条然后盖上塑料盖。按压在盖子下的支撑块以确保 IPG 胶条在水化时与电极保持良好接触。水化时加低电压（30~50 V ) 以使高分子质量蛋白质更好地进入胶内 [15，28] 。
2. 在平板仪器上进行 IPG-IEF ( Multiphor ll Unit)
满足下列条件时，水化后的 IPG 胶条可以直接放在 IEF 仪器的冷却板上：① 如果运行时间不超过 12 h ( 经常发生在宽的或中等 pH 范 围 IPG，如 IPG 3~10 或 4~7 ) 。② 如果 pH 梯度不超 过 pH 10. 0。③ 如果只用杯上样的方法加很小体积的样品 ( 20 μl ) [ 3，22 ]。使用 Immobiline 干胶条试剂盒中的上样杯更方便进行大体积的样品上样( 直至 100 μl )。当用干胶条试剂盒进行 IEF 时，IPG 胶条可以用硅树脂油或干胶条覆盖油覆盖。当样品为极端碱性（pH > 10.0 ) 蛋白质或用窄 pH 梯度（ pH 范围< 1 单位）进行微量制备电泳时必须用覆盖油等覆盖；而当 pH 范围较宽且 pH 梯度不超过 pH 10.0 ( 如 IPG 4~7 或 3~10 ) 时，使用干胶条试剂盒时可不加覆盖油。
( 1 ) 将冷却盘放入 Multiphor ll 电泳仪中。吸取 3~4 ml 煤油或 IPG 干胶条覆盖油加在冷却盘上，然后将 Immobiline 干胶条盘放在冷却盘上（图 13-2)。在胶条盘和冷却盘之间避免产生气泡。
( 2 ) 将胶条盘上的电极连至 Multiphor II 电泳仪上。
( 3 ) 将 10 ml 左右的 IPG 干胶条覆盖油或硅树脂油注入胶条盘中，将波纹状的 Immobiline 胶条标尺放在胶条盘中的覆盖油的顶端。
( 4 ) IPG 胶条水化后（见 13. 3.1 节 1.1)，用干净的镊子从水化盘中取出水化好的 IPG 胶条。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止 IEF 过程中尿素在胶表面结晶。转移水化后的 IPG 胶条（胶面朝上且酸性端对准阳极）放入槽中并靠近标尺。排列 IPG 胶条并保证对着阳极的胶条边缘排列整齐。
( 5 ) 切取两条 IEF 电极条（GE Healthcare ) 或由厚 2 mm 的滤纸（如 MN440，Macherey Nagel，Germany ) 制成的滤纸条，其长度为所有 IPG 胶条在胶条盘中排列的相应宽度。用去离子水浸泡电极条，再用滤纸吸走多余液体，然后将湿润的 IEF 电极条放在排列整齐的胶条的阴极和阳极附近。
( 6 ) 将电极放在 IEF 电极条上并轻轻向下按压电极。
( 7 ) 如果样品已经在水化时进入胶条，则用约 80 ml 干胶条覆盖油覆盖胶条，然后转至第 12 步。如果用杯上样方法，则继续第 8 步。
( 8 ) 将上样杯放入上样杯槽中，但要避免接触胶条表面。而且，确保上样杯与阳极 ( 或阴极，如果使用阴极上样）之间有几毫米的距离。
( 9 ) 将上样杯移动至合适位置，每个胶条上一个上样杯，然后轻轻向下压上样杯。上样杯要和胶条紧密接触但不能损坏胶条表面。
( 10 ) 放好上样杯之后，向胶条盘中注入约 80 ml 的干胶条覆盖油以完全覆盖 IPG 胶条。如果覆盖油漏入上样杯，吸出覆盖油，重新调整上样杯，再次检查是否漏液。在每个上样杯中加入几滴干胶条覆盖油。如果使用 pH 为 3~ 10 的宽 pH 梯度进行 IEF，加覆盖油这一步可以省略。
( 11 ) 吸取样品并加人覆盖油下的上样杯底部。再次检查是否漏液。
( 12 ) 关闭等电聚焦箱的盖子，根据表 13-1中的参数开始电泳。为使样品更好地进入胶内，最初几小时的电压应被限制在 150V 、300V、600V。然后用最大电压 3500V 电泳至稳态（见注释 4) 。电流限制在 0.05 mA/IPG 胶条。最佳聚焦温度是 20°C [ 26] 。
( 13 ) 当 IEF 结束后，从胶条盘中取出电极、上样杯槽和 IEF 电极条。用干净的镊子从胶条盘中取出 IPG 胶条。如果 IPG 胶条不被立刻用来进行第二向电泳和（或）用来进一步研究，可将它们夹在两层塑料膜之间贮存在 -70°C，可贮存数月。
3. 使用 IPGphor 电泳仪进行 IPG-IEF
使用一种叫做 IPGphor ( GE Healthcare，最近 Bio-Rad 也开发出一套类似的系统）的整体系统可使双向电泳中的 IPG-IEF 简化 IPGphor 包括一个可精确控温（在 19.5~20.5°C ) 的 Peltier 元件和一个可编程的电源。这个仪器的核心部分是不同长度的（7cm、11cm、13cm、18cm 或 24cm) 氧化铝陶瓷制的细槽，被称为持胶槽。IPG 胶条可在持胶槽中水化并同时上样，然后进行 IEF。当胶条被放入持胶槽后，后续步骤无需对胶条进行进一步操作（图 13-2)。IPGphor 是可编程的，而且最多可以存储 10 组不同程序。该仪器支持延迟启动，这使得使用者可以在下午在持胶槽中用含有样品的水化液水化胶条，然后晚上 IEF 自动启动并在第二天早上结束。
当在碱性 pH 范 围内（＞ pH 10.0 ) 进行蛋白质分离时，用杯上样的方法单独对不同的水化好的 IPG 胶条上样比用水化上样的方法上样得到的分离效果好得多。可以使用特殊杯上样（“ 通用” ）IPGphor 持胶槽，或复合式杯上样持胶槽（“ 复合式” ）进行样品的杯上样（图 13-2)。杯上样最多允许上 100 μl 样品（见注释 3) 。持胶槽平台能够调节温度并能将持胶槽与电源连接。除了操作简单外，IPGphor 的另一个优势是聚焦时间短。这是因为用 IPGphor 能在很髙的电压下（最高 8000 V ) 进行 IEF。
使用 IPGphor 进行 IEF 的典型工作条件见表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那样 ，为了使高分子质量的蛋白质更好地进入聚丙烯酰胺胶内，水化时应在胶条两端加低电压（30~50 V ) ，否则将给水化上样造成困难[ 15，28] 。然后电压逐步升高至 8000 V。如果 IPG 胶条的分离长度 < 11 cm，电压应限制在 5000 V 内。为在分离含盐量高的样品或使用窄 pH 间隔分离样品时得到最佳效果，在电压升髙至 8000 V 之前可在电极和 IPG 胶条之间垫上湿润的滤纸片（尺寸：4mm X 4mm) ( 见注释 4 ) 。当 IEF 结束后，按13. 3.1 节 2. 第 13 步中的方法贮存 IPG 胶条。
1 ) 水化上样 IEF
( 1 ) 将所需数量的持胶槽放在冷却盘或 IPGphor 的电极区（图 13-2 ) 上。吸取适量 （如 180 mm 长 IPG 胶条吸取 350 μl）的含有样品的 IPG 干胶条水化液注入持胶槽中，将 IPG 胶条胶面朝下放入水化液中，然后用 IPG 干胶条覆盖油覆盖。具体方法见 13. 3.1 节 1. 2) 。
( 2 ) 设置 IPGphor ( 所需的水化时间、伏小时、电压梯度）。
( 3 ) IPG 胶条水化后（至少需要 6 h，通常过夜），按表 13-2 所列参数开始 IEF。
( 4 ) IEF 完成后，将那些不立刻进行第二向电泳的 IPG 胶条夹在两层塑料膜之间贮存于 -70°C。
2 ) 杯上样 IEF
( 1 ) 在水化盘中用不含样品的水化液水化 IPG 干胶条。IPG 胶条水化后，用干净的镊子将水化好的 IPG 胶条从水化盘或水化盒中取出。用去离子水冲洗胶条，然后将胶条放在两层湿润的滤纸之间，用滤纸吸胶条上多余的覆盖油几秒。这样能够防止 IEF 过程中尿素在胶表面结晶。见 13. 3.1 节 2. 。
( 2 ) 将所需数量的杯上样持胶槽放在冷却盘或 IPGphor 的电极区上，确保持胶槽的尖端（阳极）与电极区的阳极区相连。可以使用复合式持胶槽代替独立持胶槽。
( 3 ) 将水化好的 IPG 胶条放入杯上样持胶槽（或复合式持胶槽）中，胶面朝上且胶条尖端（酸性端）对准阳极。确保 IPG 胶条的阴极距离槽的末端约 1.5 cm 且通过电极丝与电极连通。
( 4 ) 用去离子水润湿两张电极滤纸垫片（尺寸：4 mmX10 mm) ，用滤纸吸掉过多的去离子水，然后将润湿的电极滤纸垫片放在阳极和阴极电极与 IPG 胶条之间 IPG 胶条的表面上。如果必要（如当样品含盐量高），数小时后可以更换新的滤纸垫片。
( 5 ) 将活动电极放在电极滤纸垫片上。夹紧电极使其紧压电极滤纸垫片。
( 6 ) 将可移动的上样杯放在阳极或阴极附近，然后轻轻将上样杯压在 IPG 胶条表面上。上样杯应与 IPG 胶条紧密接触但不能损伤胶条表面。
( 7 ) 为确保上样杯不漏液，向杯中加入 100 μl IPG 覆盖油。如发现漏液，除去覆盖油并用绵纸吸净覆盖油，然后重新放置上样杯。再次检查是否漏液。上样前吸出覆盖油。
( 8 ) 每根胶条用 2~4 ml IPG 胶条覆盖油覆盖（建议不要使用硅树脂油或煤油替代 IPG 胶条覆盖油）。万一覆盖油漏入上样杯，重新放置上样杯并用绵纸吸净杯中的覆盖油。再次检查是否漏液，然后吸取样品（20~100 μl ) 加入上样杯。
( 9 ) 设置仪器（所需伏小时、电压梯度、温度等）并按表 13-2 和表 13-3 中推荐的参数进行 IEF。省去表 13-2中为水化上样推荐的低电压水化步骤。
( 10 ) IEF 完成后，继续进行平衡或第二向 IEF ( SDS-PAGE ) ( 见 13.3.3 节），或将 IPG 胶条夹在两层塑料膜之间贮存于 -70°C，可贮存数月。
3.2 IPG 胶条平衡
在进行第二向分离（SDS-PAGE ) 之前，平衡 IPG 胶条使胶条中分离的蛋白质与 SDS 充分作用十分重要。由于与载体两性电解质凝胶相比，聚焦后的蛋白质与 IPG 胶条的结合更加紧密，因此需要相对长的平衡时间（10~15 min) 以及尿素和甘油来改善蛋白质在第一向和第二向之间的转移效果。其中尿素和甘油可以减轻电渗作用的影响。目前最常用的步骤是将 IPG 胶条在一种最初由 Gorg 等 [13] 提出的缓冲液 [ 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.8) 、2% (m/V ) SDS、1% ( m/V）DTT、6 mol/L 尿素、30% (m/V) 甘油；表 13-4 中平衡 10~15 min。然后再将胶条在把上述缓冲液中的 DTT 换成 4% ( m/V ) 碘乙酰胺后形成的缓冲液中进一步平衡 10~15 min。后面的步骤是用来烷基化游离的 DTT，否则 DTT 会在第二向 SDS-PAGE 胶中迁移，从而导致点拖尾现象。该现象在银染之后就会被观察到。更重要的是，碘乙酰胺会烷基化巯基并阻止它们的氧化还原作用。我们强烈推荐使用这种还原/烷基化两步程序，这是因为它能够相当程度上简化后续质谱鉴定的样品制备工作（胶内消化蛋白质）。平衡后，IPG 胶条被放在第二向水平或垂直 SDS-PAGE 胶的表面。
( 1 ) 溶解 100 mg DTT ( Sigma-Aldrich ) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 I 。
a. 为每根胶条准备 10 ml。
b. 将每根聚焦后的胶条放入一个试管（250 mm 长 ，内径 20mm) 中，在每个试管中加入 10 ml 平衡液 I 。
c. 试管用 Pamfilm 密封后在摇床上摇动 15 min，然后倒出平衡液。也可使用较短的平衡时间（10 min) ，不过这样做的风险是在样品进入 SDS-PAGE 胶时一些蛋白质可能不会从 IPG 胶条中出来。如果这样，应当在把 IPG 胶条从 SDS 胶上取下后将 IPG 胶条染色，以检查是否所有的蛋白质离幵了 IPG 胶条。
( 2 ) 溶解 0.4 g 碘乙酰胺（Sigma- Aldrich) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 Ⅱ。
a. 为每根 IPG 胶条准备 10 ml。
b. 向每根胶条加入 10 ml 平衡液Ⅱ和 50 μl 作为 SDS-PAGE 指示剂的溴酚蓝（Serva) 溶液，再次轻轻摇动平衡 15 min。
( 3 ) 倒出平衡液Ⅱ，进行 SDS-PAGE ( 见 13.3.3 节）。如果用水平电泳槽（ 如 Muhiphor Ⅱ ) 进行 SDS-PAGE ，用去离子水短暂地冲洗 IPG 胶条，然后将胶条放在一张滤纸的一边，等待几分钟以吸净多余的平衡液。如果用垂直电泳槽（如 EttanDalt ) 进行 SDS-PAGE，用电极缓冲液短暂地冲洗 IPG 胶条。
3.3 第二向：多重垂直 SDS-PAGE
SDS-PAGE 可以在水平或垂直系统上进行 [29] 。水平设备适用于预制胶（ExcelGel SDS；Amersham Biosciences/ GE Healthcare) 。而垂直系统则应用于多块胶平行进行的电泳中，尤其是大规模的蛋白质组分析中。这种分析通常需要同时进行数批第二向 SDS-PAGE 电泳以达到更高的通量和最好的重复性 [31] 。
1. 灌制 SDS 胶
( 1 ) 灌胶胶板（200 mm X 250 mm) 由两块书本形状的 3 mm 厚的玻璃板组成。两块玻璃板用一根铰链条连接，玻璃板之间有两条 1 mm 厚的边条。将 14 块胶板垂直堆入 Ettan Dah II 的灌胶模具中。堆叠时铰链条朝右，胶板之间用塑料分隔片（如 0.05 mm 厚聚酯片）分隔。
( 2 ) 将灌胶模具的前板放好，旋上螺帽（用手拧紧）（图 13-2)。
( 3 ) 用环架将一个漏斗支撑在灌胶模具顶端上方约 30 cm 处，用一根聚乙烯管（内径 5 mm ) 与之连接。管的另一头与灌胶模具一边的侧室上的金属接口相连。
( 4 ) 向侧室中灌入 100 ml 指示剂。
( 5 ) 在即将灌胶之前，在凝胶溶液中加入 TEMED 和过硫酸氨溶液（表 13-5)。灌胶时，将凝胶溶液（830 ml) 注入漏斗。管中避免产生气泡。不要用丙烯酰胺溶液将胶板灌满。这是由于用热琼脂糖将 IPG 胶条固定在 SDS 胶顶端时需要一定的空间（约 10 mm)。
( 6 ) 当溶液注入之后，将管从侧室接口上取下。此时侧室中指示剂的水平面会下降。
( 7 ) 小心地向每块胶的顶端加入约 1 ml 覆盖液以使胶面平整光滑。
( 8 ) 让凝胶在约 20°C 聚合至少 3 h，为获得更好的重复性，最好过夜聚合。
( 9 ) 胶聚合后，将灌胶模具的前板取下，小心地从模具中取出胶板。可用刀片将胶板分开。将胶板之间的分隔片取下。
( 10 ) 用水清洗胶板以除去胶板外表面的丙烯酰胺，然后将多余液体从胶上端排出。由于电泳一次只能用掉 12 块胶板，应丢弃不理想的胶板，尤其是厚度不均匀的胶板。通常是外侧的胶板。
( 11 ) 如果聚合好的凝胶不被立即使用，可将它们用塑料包好贮存在冰箱中（4°C )。最长可贮存 2 天。
2. 使用 Ettan Dalt II 垂直电泳槽进行多重 SDS-PAGE
( 1 ) 向 Ettan Dalt II 电泳槽下槽中加入 1875 ml 电极缓冲液储液和 5625 ml 去离子水。混合并打开冷却器（25°C)。
( 2 ) 将 DALT 胶板（内有 SDS 凝胶）垂直放置在胶板架上以便放上 IPG 胶条。
( 3 ) 用电极缓冲液（用水 1 : 1 稀释）短暂冲洗平衡好的 IPG 胶 条，将胶条放在 DALT 胶板顶端。
a. 用薄刮刀或尺子推 IPG 胶条背后支持膜，使胶条进入两层玻璃板之间的空隙中。
b. 加入 2 ml 热（75°C ) 琼脂糖溶液，继续将胶条向下推向 SDS 胶表面直到两者紧密接触。IPG 胶条和 SDS 胶表面之间避免产生气泡。
c. 如需在电泳同时加入分子质量标准蛋白质，可用 5 μl 溶有 SDS 标准蛋白质的电极缓冲液浸泡一张滤纸片（2~4 mm2 ) 。弄干滤纸片后将其放在 IPG 胶条的左侧或右侧。
d. 干燥后的溶有分子质量标准蛋白质的滤纸片可放在微量离心管中贮存于 -70°C。
( 4 ) 在将胶板放入电泳设备（见第 5 步）之前让琼脂糖凝固至少 5 min。对剩余 IPG 胶条重复上述步骤。虽然将胶条埋入琼脂糖并不是必须的，但这样做能保证 IPG 胶条和 SDS 凝胶顶端结合更紧密。
( 5 ) 将胶板浸入电极缓冲液使其外侧湿润以便放入电泳槽时更容易。将胶板插入电泳槽中。如有必要，在电泳槽中空着的狭槽中放入空的胶板。将上槽穿过胶板放好，并在其中加入 2.5L 电极缓冲液（1250 ml 储液 + 1250 ml 去离子水) 。
( 6 ) 盖上电泳槽的安全盖，并开始 SDS-PAGE。开始时以每块胶 5 mA ( 设置最高 100V ) 跑大约 2 h。然后以每块胶 15 mA ( 设置最高 200V ) 过夜跑大约 16 h，或更高的电流以便跑得更快（每块胶 30 mA 大约 8 h)。
( 7 ) 当溴酚蓝踪迹迁移出凝胶下端后终止电泳。
( 8 ) 电泳结束后，小心地用塑料刮刀打开胶板。用刮刀将琼脂糖从聚丙烯酰胺凝胶上去除。小心地从玻璃板上剥下凝胶，拎着它的下缘将其放入装有固定液或染色液的盒子里。
来源：丁香实验
