植物蛋白质组学中的双向电泳技术
丁香园
1570
1. 前言
从 20 世纪 70 年代晚期以来，人们在不同的植物组织、器官、亚细胞结构和细胞器中开展了众多的寻找基因组表达差异（蛋白质组一词首次于 1994 年提出）的工作，以此来分析内部或外部刺激对蛋白表达模式的影响，如响应不同激素、化学药品或生物/非生物胁迫 （如热、冷 、干旱或臭氧），或是以此监控植物中不同生长发育阶段（ 如种子萌发、成熟或衰老) [ 1~5 ] 。
除了研究由特定基因组表达产生的蛋白质组的变化外，不同基因组产生的蛋白质组的差异也被广泛的分析 [2] 。例如，根据对蛋白表达定性和定量变化的简约分析，人们评估了种群内部和种群之间的系统进化关系和遗传距离并用来建立遗传图谱和系统进化树 [6] 。另一种应用包括为了区别和鉴定关系相近的株系、品种 [7] ，杂交后代或突变体而进行的遗传多样性评估。第三个研究领域是鉴定质量相关的分子标记（ 如烘培、麦芽制造和酿造质量[8] ) ，对植物病原（如真菌和病毒）的敏感性/抗性的标记和为植物育种定位数量性状基因（QTLs) [9] 。在最近的研究中，研究范围不仅扩展到对病原的研究，而且扩展到植物和共生微生物互作（ 如豆科植物和固氮细菌），从食物中辨认和鉴定植物过敏原（如面粉过敏原 [10]) ( 图 13-1)，或评估基因改良植物的等质同源性等方面。更加全面的总结请读者阅读这些方面的综述。
除了一些利用液相——质谱联用（ LC - MS/MS) 进行的植物蛋白质组分析外，以上提到的研究中的绝大多数是基于双向电泳（2-DE) 技术。双向电泳是——并且在可预见的将来仍将是——能够被常规化应用的用以分析大规模的复杂的蛋白质混合物（如整个细胞或组织提取物）的相应蛋白表达谱的唯一分析技术。与质谱（MS) 鉴定蛋白质技术结合，双向电泳目前是蛋白质组的主要工具。双向电泳结合了等电聚焦 （IEF ) 和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE ) ，根据两种不同的参数分离变性蛋白质，第一向根据等电点 （pI）第二向根据分子质量 （ Mr）。在一定的凝胶尺寸和 pH 梯度下，双向电泳可以同时分离超过 5000 个蛋白质（通常约 2000 个蛋白质），而且在使用高灵敏度蛋白质检测方法时能够定量检测 < 1 ng 的蛋白质点（图 13-1)。同样重要的是，它能得到完整蛋白质的图谱。图谱反映了蛋白质表达、异形体或翻译后修饰的变化 。与之相比，基于 LC-MS/MS 的方法分析的是肽段，不能得到蛋白质的分子质量和等电点的信息，而且进行定量分析时需要稳定的同位素标记。
最早的蛋白质组研究是由 O’ Farrell 在 1975 年报道的利用双向电泳进行的研究该研究采用载体两性电解质形成的 pH 梯度进行第一向电泳。利用固定 pH 梯度 ( IPGs) 作为第一向的双向电泳技术的引入很大程度上克服了双向电泳技术中的一些限制 [13] ，包括重复性、操作、分辨率、极酸性和（或）碱性蛋白的分离和样品载量。
IPGs 是基于两性 ImmobilineR 的应用。两性 ImmobilineR 是由 10 种有一定化学结构的丙烯酰胺衍生物组成的一系列试剂，其基本结构是 CH2=CH—CO-NH—R。其中 R 基包含一个羧基或氨基。它们形成 pK 1~13 的一系列缓冲体系。反应末端同丙烯酰胺一起聚合在凝胶结构中，这样就形成了非常稳定的 pH 梯度。在这样的梯度中能够进行真正的稳态等电聚焦并提高重复性。窄 pH 范围的 IPGs 不仅提高了分辨率（Apl =0.001)，而且可以检测低丰度蛋白。同时，pH 为 12 的碱性蛋白质已经被人们利用 IPG 技术在真稳态状况下分离得到 [17] 。
其他技术方面的进步也同样为双向电泳技术在蛋白质组分析中的广泛应用做出贡献。这些进步包括：用以溶解疏水蛋白质的溶解性更强的试剂，用来半自动地平行运行多个凝胶的设备，用来提高重复性、蛋白点定量精确性和简化蛋白点比较的基于荧光染料的更加敏感的蛋白质检测方法，以及用来分析复杂双向凝胶的更加成熟的计算机软件[11] 。
一般而言，由于蛋白质理化性质和丰度的多变，蛋白质组分析在技术上比基因组分析的风险更大。例如，据估计在高等真核生物 （如植物）中超过 20000 个基因。而由于不同的蛋白质剪接、蛋白质水解、磷酸化、糖基化和百余种其他可能的翻译后修饰，这些基因能翻译成 50000~100000 种蛋白质。幸运的是，在一个特定的组织和时间里，并不是所有这些蛋白质都会表达。不过，表达蛋白质的种类很可能至少为 10000~20000。而且，植物蛋白质组分析面临一些特殊的挑战。特别是蛋白质样品制备很困难。这是因为植物坚硬的细胞壁以及中央液泡中积累的大量的干扰化合物，如酚、色素和水解酶。这些物质在组织破碎过程中会造成蛋白质的降解和（或）沉淀[ 19，20 ] 。另外，由于通常绿色植物组织中的蛋白质含量很低（一般为 2%，而哺乳动物组织或微生物细胞中大约是 20% ) ，经常需要使用富集蛋白质的方法。
尽管有上述的不利因素，2-DE-MS 已经被成功地运用到整个植物组织和亚细胞水平的蛋白质组分析中。经典的 2-DE-MS 的主要流程有：① 样品制备/预分离和蛋白质溶解；② 用双向电泳分离蛋白质；③ 蛋白质检测和定量；④ 计算机辅助分析双向电泳图谱；⑤ 质谱鉴定蛋白质；⑥ 双向蛋白质数据库构建。本文的余下部分将重点描述基于 IPGs 的双向电泳技术（方法 1 )；在此其他方法将不予讨论。关于这些方面，读者可以查阅本书的相应章节和参考文献 [1]、[ 11 ] 和 [15]。
简单来说，采用了固定 pH 梯度的双向电泳技术的第一向（ IEF ) 是依据 Gorg 等 [13] ；于 2000 年 [ 15 ] 和 2004 年 [11] 更新的方法，采用独立的，宽 3 mm、最长至 24 cm 的，附着在 GelBond PAGfilm 支持膜上的 IPG 胶条（实验室自制或市售 Immobiline 干胶条）进行的。样品可以通过杯上样或水化上样的方法进入胶条。IEF 完成后，IPG 胶条经含有尿素、甘油、二硫苏糖醇（DTT ) 和碘乙酰胺的 SDS 缓冲液平衡后转移至水平或垂直的 SDS 胶上进行第二向。利用半自动仪器可以在相当程度上简化双向电泳。
例如，使用 IPGphor 进行第一向，并使用多个 SDSA-PAGE 仪器可平行分离最多 20 个不同样品。电泳完成后，经分离的蛋白质通过染色的方法显示出来。染色方法包括使用硝酸银或有机染料染色，使用放射自显影（或磷光成像）显示同位素标记的样品，或最好利用荧光分子染料标记或显色 [11] 。
从 20 世纪 70 年代晚期以来，人们在不同的植物组织、器官、亚细胞结构和细胞器中开展了众多的寻找基因组表达差异（蛋白质组一词首次于 1994 年提出）的工作，以此来分析内部或外部刺激对蛋白表达模式的影响，如响应不同激素、化学药品或生物/非生物胁迫 （如热、冷 、干旱或臭氧），或是以此监控植物中不同生长发育阶段（ 如种子萌发、成熟或衰老) [ 1~5 ] 。
除了研究由特定基因组表达产生的蛋白质组的变化外，不同基因组产生的蛋白质组的差异也被广泛的分析 [2] 。例如，根据对蛋白表达定性和定量变化的简约分析，人们评估了种群内部和种群之间的系统进化关系和遗传距离并用来建立遗传图谱和系统进化树 [6] 。另一种应用包括为了区别和鉴定关系相近的株系、品种 [7] ，杂交后代或突变体而进行的遗传多样性评估。第三个研究领域是鉴定质量相关的分子标记（ 如烘培、麦芽制造和酿造质量[8] ) ，对植物病原（如真菌和病毒）的敏感性/抗性的标记和为植物育种定位数量性状基因（QTLs) [9] 。在最近的研究中，研究范围不仅扩展到对病原的研究，而且扩展到植物和共生微生物互作（ 如豆科植物和固氮细菌），从食物中辨认和鉴定植物过敏原（如面粉过敏原 [10]) ( 图 13-1)，或评估基因改良植物的等质同源性等方面。更加全面的总结请读者阅读这些方面的综述。
除了一些利用液相——质谱联用（ LC - MS/MS) 进行的植物蛋白质组分析外，以上提到的研究中的绝大多数是基于双向电泳（2-DE) 技术。双向电泳是——并且在可预见的将来仍将是——能够被常规化应用的用以分析大规模的复杂的蛋白质混合物（如整个细胞或组织提取物）的相应蛋白表达谱的唯一分析技术。与质谱（MS) 鉴定蛋白质技术结合，双向电泳目前是蛋白质组的主要工具。双向电泳结合了等电聚焦 （IEF ) 和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE ) ，根据两种不同的参数分离变性蛋白质，第一向根据等电点 （pI）第二向根据分子质量 （ Mr）。在一定的凝胶尺寸和 pH 梯度下，双向电泳可以同时分离超过 5000 个蛋白质（通常约 2000 个蛋白质），而且在使用高灵敏度蛋白质检测方法时能够定量检测 < 1 ng 的蛋白质点（图 13-1)。同样重要的是，它能得到完整蛋白质的图谱。图谱反映了蛋白质表达、异形体或翻译后修饰的变化 。与之相比，基于 LC-MS/MS 的方法分析的是肽段，不能得到蛋白质的分子质量和等电点的信息，而且进行定量分析时需要稳定的同位素标记。
最早的蛋白质组研究是由 O’ Farrell 在 1975 年报道的利用双向电泳进行的研究该研究采用载体两性电解质形成的 pH 梯度进行第一向电泳。利用固定 pH 梯度 ( IPGs) 作为第一向的双向电泳技术的引入很大程度上克服了双向电泳技术中的一些限制 [13] ，包括重复性、操作、分辨率、极酸性和（或）碱性蛋白的分离和样品载量。
IPGs 是基于两性 ImmobilineR 的应用。两性 ImmobilineR 是由 10 种有一定化学结构的丙烯酰胺衍生物组成的一系列试剂，其基本结构是 CH2=CH—CO-NH—R。其中 R 基包含一个羧基或氨基。它们形成 pK 1~13 的一系列缓冲体系。反应末端同丙烯酰胺一起聚合在凝胶结构中，这样就形成了非常稳定的 pH 梯度。在这样的梯度中能够进行真正的稳态等电聚焦并提高重复性。窄 pH 范围的 IPGs 不仅提高了分辨率（Apl =0.001)，而且可以检测低丰度蛋白。同时，pH 为 12 的碱性蛋白质已经被人们利用 IPG 技术在真稳态状况下分离得到 [17] 。
其他技术方面的进步也同样为双向电泳技术在蛋白质组分析中的广泛应用做出贡献。这些进步包括：用以溶解疏水蛋白质的溶解性更强的试剂，用来半自动地平行运行多个凝胶的设备，用来提高重复性、蛋白点定量精确性和简化蛋白点比较的基于荧光染料的更加敏感的蛋白质检测方法，以及用来分析复杂双向凝胶的更加成熟的计算机软件[11] 。
一般而言，由于蛋白质理化性质和丰度的多变，蛋白质组分析在技术上比基因组分析的风险更大。例如，据估计在高等真核生物 （如植物）中超过 20000 个基因。而由于不同的蛋白质剪接、蛋白质水解、磷酸化、糖基化和百余种其他可能的翻译后修饰，这些基因能翻译成 50000~100000 种蛋白质。幸运的是，在一个特定的组织和时间里，并不是所有这些蛋白质都会表达。不过，表达蛋白质的种类很可能至少为 10000~20000。而且，植物蛋白质组分析面临一些特殊的挑战。特别是蛋白质样品制备很困难。这是因为植物坚硬的细胞壁以及中央液泡中积累的大量的干扰化合物，如酚、色素和水解酶。这些物质在组织破碎过程中会造成蛋白质的降解和（或）沉淀[ 19，20 ] 。另外，由于通常绿色植物组织中的蛋白质含量很低（一般为 2%，而哺乳动物组织或微生物细胞中大约是 20% ) ，经常需要使用富集蛋白质的方法。
尽管有上述的不利因素，2-DE-MS 已经被成功地运用到整个植物组织和亚细胞水平的蛋白质组分析中。经典的 2-DE-MS 的主要流程有：① 样品制备/预分离和蛋白质溶解；② 用双向电泳分离蛋白质；③ 蛋白质检测和定量；④ 计算机辅助分析双向电泳图谱；⑤ 质谱鉴定蛋白质；⑥ 双向蛋白质数据库构建。本文的余下部分将重点描述基于 IPGs 的双向电泳技术（方法 1 )；在此其他方法将不予讨论。关于这些方面，读者可以查阅本书的相应章节和参考文献 [1]、[ 11 ] 和 [15]。
简单来说，采用了固定 pH 梯度的双向电泳技术的第一向（ IEF ) 是依据 Gorg 等 [13] ；于 2000 年 [ 15 ] 和 2004 年 [11] 更新的方法，采用独立的，宽 3 mm、最长至 24 cm 的，附着在 GelBond PAGfilm 支持膜上的 IPG 胶条（实验室自制或市售 Immobiline 干胶条）进行的。样品可以通过杯上样或水化上样的方法进入胶条。IEF 完成后，IPG 胶条经含有尿素、甘油、二硫苏糖醇（DTT ) 和碘乙酰胺的 SDS 缓冲液平衡后转移至水平或垂直的 SDS 胶上进行第二向。利用半自动仪器可以在相当程度上简化双向电泳。
例如，使用 IPGphor 进行第一向，并使用多个 SDSA-PAGE 仪器可平行分离最多 20 个不同样品。电泳完成后，经分离的蛋白质通过染色的方法显示出来。染色方法包括使用硝酸银或有机染料染色，使用放射自显影（或磷光成像）显示同位素标记的样品，或最好利用荧光分子染料标记或显色 [11] 。
