X 射线晶体学

蛋白质实验

别名：

X－ray crystallography

最新修订时间：2022-02-10

简介

蛋白质分子能够结晶的现象在 170 多年以前就已被报道。1895 年 R？ntgen WC 发现 X－射线和 1912 年 Laue MV 发现晶体的 X－射线衍射（X－raydiffraction）现象，开创了晶体结构研究的新纪元。1953 年，Perutz MF 用重原子同晶置换法解决了生物大分子晶体结构测定中衍射的相位问题。1957 年和 1959 年，Kendrew JC 和 Perutz MF 分别获得了肌红蛋白和血红蛋白的低分辨率空间结构，从此，X－射线晶体衍射技术逐渐成为研究生物大分子空间结构的重要手段。

通过 X－射线晶体学方法解析蛋白质空间结构的主要步骤包括：①蛋白质结晶；②X－射线衍射数据收集；③由衍射数据和相位信息计算电子密度；④蛋白质结构模型的建立和修正。

X 射线晶体学包含五种方法：蛋白质结晶、X－射线衍射技术解析蛋白质晶体结构、同晶置换法、分子置换法和多波长反常散射法。

原理

蛋白质 X－射线晶体学（X－ray crystallography）的基本原理主要包括蛋白质晶体的制备和使用 X－射线晶体学解析蛋白质晶体空间结构两部分原理组成。

（一）蛋白质结晶的原理

当蛋白质溶液达到过饱和状态时，处于随机状态的蛋白质分子转变成有序排列的状态并从溶液中析出，这一有序化的过程即蛋白质结晶。由于蛋白质分子量较大，几何形状复杂，表面电荷多样，局部结构可能具有较高的柔性，有的蛋白质在溶液中易发生聚集沉淀等，获取分子有序排列的蛋白质单晶是比较困难的，目前仍然是晶体结构解析的瓶颈之一。

蛋白质结晶过程可以分为两个阶段，首先是形成晶核，然后是周围分子向晶核聚集，晶体逐渐长大。一定大小晶核的形成是晶体形成的决定因素，如果晶核太小就可能溶解。蛋白质结晶技术的关键在于控制蛋白质溶液的过饱和程度以及达到过饱和的速度。如果蛋白质溶液高度过饱和，蛋白质分子将以无定形沉淀的形式析出。蛋白质结晶时，应首先使蛋白质溶液缓慢趋于饱和，进而达到一个适宜的过饱和度，形成少量的晶核。蛋白质分子不断结合到晶核上，溶液过饱和度逐渐降低，最后溶液和晶体处于平衡状态。

（二）X－射线衍射技术解析蛋白质晶体结构的原理

蛋白质晶体中的分子排列具有规则、对称性及周期性的特点。当 X－射线从特定方向进入晶体后，与晶体中原子的电子发生相互作用而产生散射。原子的电子越多，散射能力越强。晶体中各个原子的电子散射的电磁波在空间相干叠加，形成衍射光束。衍射线的方向，即衍射图上斑点的位置由晶体中最小的重复单元－晶胞的大小和形状决定；而晶胞内所有原子的电子对衍射斑点的强度都有贡献。因此，测定衍射线的方向可以确定晶胞参数，而测定衍射斑点的强度，通过傅立叶变换可计算出晶胞内的电子密度分布，再由此推测晶胞内分子的原子空间坐标。

衍射线与晶胞参数的对应关系可以由 Laue 方程或 Bragg 方程给出。Bragg WL 指出，晶体所产生的衍射可以看作是 X－射线束被晶体的一系列平行平面反射造成的。只有当反射线光程差等于 X－射线束波长的整数倍时，才能产生衍射。Bragg 定律给出了 X－射线波长 λ、反射角 θ 和晶面间距 d_hkl 之间的关系：nλ ＝ 2d_hklsinθ。X－射线波长λ是已知的，反射角θ可以由衍射数据获得，因而可以得到晶面间距 dhkl。

电子密度 p 在空间坐标（xyz）处的值可以由以下函数给出：

其中，V 指晶胞总体积，IF（hkl）l 是结构振幅，α（hkl）是相位，hkl 是密勒指数（miller indices）。电子密度函数与结构振幅和相位有关。在衍射实验中，衍射点的强度信息可以被录。结构振幅可以从衍射强度推导得到。然而，衍射数据的相位无法从实验收集的数据中直接得到。晶体结构解析的核心问题之一就是解决相位问题。目前发展出一系列方法来获取相位信息。

1．同晶置换法两个晶体如果具有相同的空间对称性和相同的晶胞参数，称之为同晶型。在不改变分子和晶体结构的情况下，蛋白质晶体（母体）经过化学修饰（如局部被重原子置换）可得到衍生物晶体。由于引入的重原子仅影响晶体的衍射强度，而不改变衍射方向，通过比较两者的衍射图像（如帕特森函数法）可以得到衍生物晶体中重原子的位置信息及蛋白质母体的相位信息。

2．分子置换法对于结构同源性较高的蛋白质或突变体蛋白质以及蛋白质的化学修饰物来说，彼此的空间结构往往十分相似，仅仅是结构细节有所不同。这时可以利用已知的同源结构作为待测蛋白质的模型，计算其结构因子并同实验测定结果比较而确定相位。这种方法要求两者具有较高的结构相似度。

3．多波长反常散射法当 X－射线的频率接近原子光谱吸收带时，X－射线不仅被散射，还会被共振吸收，从而扰乱了正常散射，这种情况下产生的散射称为反常散射。反常散射效应对于重原子尤为明显。对于类似于上述的重原子衍生物，至少两个波长的反常散射也可用于获取相位信息。

来源：丁香实验团队