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简介
原理
放射性核素示踪法蛋白质磷酸化分析的基本原理是:只要有适宜的前体物质可以用于标记,放射性核素示踪理论上就可以应用于所有的翻译后修饰分析。利用 32 P 标记的无机磷酸盐 (32 Pi) 进行生物合成标记可以用于观察细胞的磷酸化状态变化。
来源:丁香实验团队
操作方法
特定蛋白免疫沉淀后的磷酸氨基酸分析是放射性核素示踪法用于蛋白质磷酸化分析的一种方法。如果在细胞裂解后,利用特异性抗体进行免疫沉淀后再行酸水解,放射性自显影的信号则可以确定该种蛋白在哪种氨基酸残基上发生了磷酸化。如果 1 条多肽链中只有 1 个丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸被磷酸化,磷酸化位点的确定比较容易,但是在大多数情况下,蛋白质都存在数个磷酸位点,使得分析比较困难。
免疫复合物的体外激酶活性测定体外蛋白激酶活性测定 (in vitro kinase assay) 实际上是在无细胞体系中 利用 γ-32 P-ATP 作为磷酸基团供体进行的蛋白质磷酸化分析。