【转帖】质谱分析蛋白质磷酸化位点

1．材料

试剂：ZipTipMC，ZipTipμ-C18 为millipore公司产品。磷酸化蛋白β-casein蛋白为sigma产品，纯度90％。Trypsin为德国Roche诊断公司经修饰的测序级的酶（产品编号1418025），硝酸鉫（Ga(NO3)3）为Aldrich公司产品；实验用水为Milli-Q纯水器制备的超纯水。

色谱纯乙腈为美国Fisher Scientific 产品；a-氰基-4-羟基肉桂酸(a-CCA)为Bruker提供；三氟乙酸(TFA)为 Fluka公司产品。其它试剂均为国产分析纯。

仪器：电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪（Q-Tof2，Micromass），配有masslynx数据系统。基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪(Autoflex，Bruker)。

2．方法

1) 蛋白的溶液酶切：

称取标准磷酸化蛋白β-casein 50μg，溶于50μL 25mM NH4HCO3中。 加入分装保存的胰蛋白酶1 ug，37℃，12h后取出部分稀释成所需浓度备用。

2) 离子亲和层析IMAC法富集磷酸化肽段：

①ZipTipMC用0.1％乙酸／50％乙腈／水溶液洗3次，

②用200mM Ga(NO3)3溶液洗10次，

③用超纯水洗3次，

④用1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗3次，

⑤0.1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗5次，

⑥蛋白质酶解混合物用酸性溶液（20％乙酸或1％甲酸水溶液）调pH至2以下，用ZipTipMC吸取、排出10次以上，

⑦ZipTipMC用0.1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗6次，

⑧用超纯水洗3次，

⑨2－3μL 0.3N氨水洗脱；

3) 质谱分析：

电喷雾质谱仪为英国Micromass公司的电喷雾四极杆正交加速飞行时间串联质谱仪Q-TOF2。配备毛细管液相色谱和纳升喷雾源。镀金属钯的硼硅酸盐电喷雾针（palladiμm-coated borosilicate electrospray needle）(Protana, Odense, Denmark)是一次性使用的专用needle。

碰撞气体为氩气。源温80C，锥孔电压50V左右。TOF 加速电压为9.1KV。MCP 检测器电压为2200V。当进行手动测序时，毛细管电压为800-1200V可得到稳定的喷雾。调节碰撞能量和碰撞气体的大小使得到一个好的串联质谱图。

该质谱图经Micromass的专用软件MaxEnt3处理后，用Micromass的专用软件MasSeq直接推倒出肽段序列。Nanoflow probe进样毛细管电压为3000v。所有测定均在正离子方式下进行，用Glu-fib(sigma)的串联质谱碎片校正，质量准确度±0.2Da。

中性丢失扫描：设定扫描范围400－2000，扫描方式为中性丢失扫描，寻找中性丢失49的双电荷离子。

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪为Bruker公司的Autoflex，将样品溶于0.1%TFA中，取1μL与饱和CCA基质上清液混合，取1μL点在Scorce384靶上，送入离子源中进行检测。

反射检测方式；飞行管长2.5m；氮激光器：波长337nm；加速电压25KV；检测电压1.6KV；反射电压23KV。校正用Peptide Calibration Standard(Bruker)。