方案6 MALDI-MS确定酪氨酸磷酸化位点实验

一、SDS-PAGE 分离的 Gab-I 蛋白的消化

1.把通过自显影确定的含有磷酸化蛋白的条带切下来。

2.将凝胶切成 1mm2 的条带，把它们放到检测管中。

用特定的不含 Na+、K+的试管消化，否则 Na+、K+的化合物会在 MS 中出现。

3.用消化缓冲液 A 洗凝胶条，37°C，lOmin。

4.用消化缓冲液 B 洗凝胶条，37°C，lOmin。

5.重复③、④步两次以上。

6.室温下加乙腈使凝胶条带脱水，直到胶条变白（约 3 min)。

7.加蛋白酶溶液，37°C，20 min，使凝胶膨胀。

酶解温度取决于所用的蛋白酶（例如，Glu-C 需要在 25°C，而胰蛋白酶需要在 37°C)。

8.在凝胶块上加消化缓冲液 A 防止其干燥，37°C 下孵育过夜。

二、用于阴离子交换色谱的凝胶条带的抽提

9.加 20ul 消化缓冲液 A 到凝胶中，4°C 下超声 20 min。

10.收集上清。

11.重复⑨、⑩步两次以上。

三、阴离子交换色谱

12.调整阴离子交换柱的流速为0.5 ml/min。

13.把合并的上清液，加到柱子上。

14.用离子交换缓冲液 A 洗柱子 20 min。

15.用呈现 0~10% 的梯度离子交换缓冲液 B，从柱子上洗脱多肽，持续 40 min，在洗脱过程中每分钟收集0.5 ml 的洗脱液。

16.提高离子交换缓冲液 B 的梯度，即 10%~50%，持续 75 min。

17.用 Cerenkov 计数器测量每一组分的放射性，或测量经闪烁放大的每一组分的放射性。

18.按每一部分的相对放射性对洗脱时间作图（例子见图 9.14)。

四、对有放射性的洗脱液作 RP-HPLC 色谱分析

19.从阴离子交换色谱洗脱液中选一个具有放射性的组分。

20.用一个离心干燥器将其体积由 500ul 减小到 80ul。

21.调整 M-HPLC 柱的流速到 704/min。

22.用一个死体积 T-分流器调整 y-HPLC 柱子的流速到 16ul/min。

23.把样品加到一个 80ul 的进样环管中。

24.用 95% 的 pRP-HPLC 缓冲液 A 洗柱子 30 min。

25.UV 检测器调零，光度计的采样频率设为 2 Hz，在 215nm 和 295nm 下对 RP-HPLC 洗脱液进行 UV 检测。

26.用 5%~50% 的梯度 JLtRP-HPLC 缓冲液 B 洗脱，持续 90 min。

27.收集洗脱液，使每一组分的体积为 8~16ul。

28.从每一组分中取 0.5ul 转移到小瓶中进行放射性的测量。

组分的体积依赖于峰的大小

29.将这些组分在-70°C 下迅速冷却，图 9.15 显示了一个典型的 RP-HPLC 色谱图。

五、对于放射性的组分作 MALDI-MS 分析

30.从 RP-HPLC 中选一个具有放射性的组分，把0.3ul 的收集液加到不锈钢的 MALDI 板上。

31.加 0.3ul 的基质溶液到样品上，空气中自然干燥（约 1 min)。

32.以线性或反射的模式记录 MALDI 谱图（见图 9.16)。

33.把从 MALDI-MS 谱图中获得的理论计算（inSilic0) 的多肽质量与理论消化憐酸化蛋白（如 GPMAW，Protein-Prospector) 所获得的实验性质量进行比较。要考虑以下几个方面：

（1）甲硫氨酸的氧化；

（2）氨基端的乙酰化；

（3）S、T、Y 的磷酸化（本实例中是 Y 的磷酸化）；

（4）XXRQXX 和 XXKQXX 上焦谷氨酸的产生；

（5）不完全消化。

34.选择可能的鱗酸化多肽做 MALDI-PSD 分析。图 9.17 和图 9.18 显示了磷酸化酪氨酸多肽的 4 种不同 MALDI-PSD 谱图。图 9.19 中显示了多肽一般的片段化模式。